多位点蛋白修饰检测的middle-down组学质谱分析新方法

There are more than 400 reported posttranslational modifications (PTMs), these PTMs play key regulator roles in biological processes, often through the interplay of multiple PTMs. The development of a proper analytical tools that can capture the interplay and dynamic changes of PTMs is critical to pinpoint their regulating roles. Bottom-up proteomics is currently the most popular approach for the analysis of PTMs; however, analyses at peptide levels (< 10 AAs in average) can hardly capture the connection information between PTMs or differentiate proteforms and lead to ambiguous quantitation, making it difficult to accurately discover the regulating mechanism of PTMs. Our previously research results demonstrated that middle-down proteomics approach targeting larger peptides (3~15 kDa) can better preserve the connection information between PTMs and differentiate proteoforms. In this project, we will approach the challenge of obtaining large peptides through both enzymatic and chemical-mediated digestion methods to yield large peptides, and we will also optimize the whole workflow for the goal of establishing a well-developed MD proteomic method. This research will greatly advance our analytical capability for understanding the regulating mechanisms of PTMs from multiple levels. More broadly, this work will advance drug target discovery and drug development.

蛋白翻译后修饰（PTMs）种类繁多、变化动态且常通过相互作用调控生命过程，因此开发可以捕捉PTMs关联信息及动态变化的检测新方法是研究PTM调控机制的基础。鸟枪蛋白质组学技术是目前分析PTMs的主流手段，这种基于小肽段（平均10AAs）的分析技术的最大问题在于会导致PTM间关联信息的缺失、同源蛋白异质体难以区分及定量结果存在歧义，无法准确揭示PTMs的功能和互作调控机制。本课题组前期工作显示以大肽段（3～15kDa）为分析目标的middle-down (MD）组学技术可以更加完整的保存PTMs间关联信息和区分蛋白异质体。针对大肽段难于获取等技术难题，本项目拟从蛋白酶和化学酶切试剂两个途径寻找目标肽段获取方案，并对MD流程及不同物种来源的样品进行全方位方法优化，旨在解决MD组学方法构建中的瓶颈问题，建立完善的PTMs分析新方法，为揭示PTM互作调控机制和功能奠定基础，推动药靶发现及药物。

蛋白翻译后修饰（PTMs）种类繁多、变化动态且常通过相互作用调控生命过程，因此开发可以捕捉PTMs关联信息及动态变化的检测新方法是研究PTM调控机制的基础。鸟枪蛋白质组学技术bottom-up proteomics (BUP)是目前分析PTMs的主流手段，这种基于小肽段（平均10AAs）的分析技术的最大问题在于会导致PTM间关联信息的缺失、同源蛋白异质体难以区分及定量结果存在歧义，无法准确揭示PTMs的功能和互作调控机制。而以大肽段（3～15kDa）为分析目标的middle-down proteomics (MDP）组学技术可以更加完整的保存PTMs间关联信息和区分蛋白异质体。针对大肽段难于获取等技术难题，我们分别从构建基于固定化酶反应器、挖掘新型蛋白酶以及基于微流控芯片的化学酶切三种不同策略探索了适用于MDP的样品制备方法，结果显示基于固定化酶反应器的限制性酶切有助于快速样品制备以及长肽段的获取，新挖掘的酸性蛋白酶在完整混合蛋白以及细胞总蛋白提取物中均显示可以用于符合MDP需求的长肽段制备，而基于微流控芯片的微反应有利于加速化学酶切。此外，我们进一步搭建了自上而下蛋白质组学方法（top-down proteomics, TDP）蛋白质组学方法提升蛋白异质体鉴定能力，并以核糖体蛋白为样本展示其在核糖体异质体中鉴定的能力。针对抗体样本，我们构建了基于BUP、BUP和de novo测序的组合分析流程。目前，MDP技术在复杂样本分析中的应用仍需要进一步完善，但总体而已，MDP技术的开发以及其与其他组学技术的整合必将在生物、临床诊断、靶点发现等研究领域发挥更大作用。

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