利用CRISPR/Cas9技术构建TSC1+/-巴马小型猪作为肿瘤等疾病大动物模型

mTOR is the center signaling molecule of cell growth regulation, sense of nutrition, and metabolism. Its activation is closely associated with tumorigenesis. Until now, there are only mouse tumor models related to mTOR signaling pathway and such large animal model has not been reported. Tuberous sclerosis 1 (TSC1) as the suppressor gene of mTOR plays an important role in tumor development, cell growth and proliferation. In mice, TSC1 homozygous knockout is lethal, while mTORC1 was activated by monoallelic modified TSC1 (TSC1+/-). Therefore, the main aims of this project are (1) to produce TSC1+/- Bama miniature pigs using CRISPR/Cas9 technology; (2) to study the phenotypes of TSC1+/- pigs, including the development of tumors in the brain, kidney, skin and heart; (3) to study other phenotypes related to the mTORC1 activation in TSC1+/- pigs, such as glycolipid metabolism, blood biochemistry, liver, renal function and vascular changes, etc.; (4) to study the changes of TSC1 and mTOR related signaling pathways in vitro. This study will provide an effective large animal model for the screening of anti-cancer drugs via mTORC1 as target.

mTOR是感受营养、调控细胞生长与代谢的中心信号分子，mTORC1活化与肿瘤发生密切相关，但目前关于mTOR信号通路仅有小鼠及低等生物肿瘤模型，缺少大动物模型。肿瘤抑制因子结节硬化复合体1 (TSC1)作为mTOR的抑制基因在肿瘤发生、细胞生长与增殖、细胞周期调节中占重要的地位。小鼠TSC1纯合敲除引起致死，而TSC1单等位基因敲除会引起mTORC1异常活化。本项目的主要目的：利用CRISPR/Cas 9技术构建TSC1单等位基因敲除（TSC1+/-）的巴马小型猪模型；研究TSC1+/-巴马小型猪结节性硬化症相关表型，包括大脑，肾脏，皮肤及心脏的肿瘤发生情况；研究TSC1+/-巴马小型猪mTORC1活化相关的其他表型如糖脂代谢、血生化、肝、肾功能、血管变化等；利用体外细胞培养和分子生物学手段研究TSC1以及mTOR相关信号通路的变化，为筛选靶向mTORC1治疗肿瘤的药物提供大动物模型。

研究背景：结节性硬化症（TS）是由肿瘤抑制基因结节性硬化症复合物1（TSC1）或结节性硬化症复合物2（ TSC2）突变导致的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）信号通路过度激活而引起的显性遗传性疾病。mTORC1通路过度激活可致其下游靶点激活，细胞的生长和增殖、蛋白质的翻译等增加。病变涉及大脑、皮肤、眼睛、肾脏、心脏和肺, TS临床特征独特，包括大脑皮层（结节）畸形、胎儿期心脏横纹肌瘤及多器官错构瘤增生等，严重影响患者的生活质量。目前，临床上尚未出现治愈此病的有效方法。动物模型是揭示TS的病理机制和研究诊治策略的重要工具，但迄今仅有TS小鼠模型的报道。由于小鼠和人类在基因表达、生理方面等差异大，TS小鼠模型不能重现TS疾病的重要病理特征，创建更为理想的TS疾病动物模型显得十分迫切。.研究内容：1.利用CRISPR/Cas 9技术构建TSC1单等位基因敲除（TSC1+/-）的巴马小型猪模型；2.研究TSC1+/-巴马小型猪结节性硬化症相关表型，主要包括脑，肾脏及心脏的肿瘤发生情况；3.研究TSC1+/-巴马小型猪mTORC1活化相关的其他表型，为筛选靶向mTORC1治疗肿瘤的药物提供有效的大动物模型。.结果：经G418药物筛选后得到40个雄性单细胞克隆，测序鉴定后获得8个TSC1+/-单细胞克隆。通过SCNT，获得12头仔猪，基因型鉴定10头仔猪为TSC1+/-克隆猪。荧光定量PCR结果显示TSC1+/-猪心脏和肾脏中的TSC1基因表达低于野生型对照。Western blot和IHC检测结果显示TSC1+/-猪心脏和肾脏的p-S6水平明显升高。IHC结果显示Ki67在TSC1+/-克隆猪脾脏中的表达增高。H&E染色结果显示TSC1+/-新生仔猪心脏出现多个横纹肌瘤；MRI的T2加权成像结果显示TSC1+/-新生仔猪脑内出现多个室管膜下结节。.意义：本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得TSC1+/-巴马克隆猪，同时也证明该技术为高效的特异序列基因编辑提供了一种快速且灵活的工具。实验结果显示TSC1敲除猪体内的mTORC1通路被过度激活；敲除仔猪出现明显的心脏横纹肌瘤和室管膜下结节，与TS患者的两个主要临床特征一致。本研究创建的TSC1+/-巴马猪模型可以作为理想的TS疾病大动物模型，为深入揭示TS的病理机制和研究诊治策略打下基础。

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