海洋萎缩芽孢杆菌Bacillamide C生物合成机制研究

Red tide and algal bloom caused by algae have severely threat to ecology,economy and human health. Microorganisms grow quickly and are considered as one of the most promising algicides. Bacillamide as microbial algicide,its biosynthetic mechanism is urgently needed to be studied.In our previous study, Bacillus atrophaeus C89 isolated from sponge can produce Bacillamide C. The synthesis genes of Bacillamide C are predicted composing of gene clusters NRPS (non-ribosomal peptide synthase) and downstream decarbosylase gene (decT). In this study, based on genome sequence of Bacillus atrophaeus C89, essential gene cluster nrps involved in Bacillamide C biosynthesis will be knocked out.Gene clutster nrps will be cloned and expressed in Escherichia coli. The purified recombinant protein, NRPS module protein and DecT, will be used to synthesize Bacillamide C. The study on biosynthetic mechanism of Bacillamide C will provide theoretical support for combinational biosynthesis of Bacillamide analogues.

藻类引起的赤潮和水华,对生态、经济和人类健康的威胁日益严重，微生物因其繁殖快、抑藻效率高等优点被认为是最有前途的控藻方法之一。Bacillamide作为微生物抗藻剂，其生物合成机制急需深入研究。我们前期从海绵中分离的Bacillus atrophaeus C89菌株产生Bacillamide C, 推测其生物合成基因含有NRPS基因簇和色氨酸脱羧酶基因。本项目在Bacillus atrophaeus C89基因组测序的基础上，通过基因敲除确定Bacillamide合成的必需基因，并通过克隆和体外表征化NRPS基因簇编码的模块蛋白、脱羧酶等，解析Bacillamide C的生物合成机理，为利用组合生物合成获得Bacillamide类似物奠定基础。

海洋海绵所产生的生物活性天然产物是由其共生的微生物产生。我们前期从贪婪倔海绵中分离的Bacillus atrophaeus C89菌株能产生抗藻化合物Bacillamide C, Bacillamide C的生物合成机制急需深入研究。 Bacillamide C化合物具有吲哚和噻唑环结构，根据结构推测由丙氨酸、半胱氨酸、色氨酸缩合而成，根据C89的基因组信息，推测bacillamide C的生物合成由nrps基因簇和下游的芳香族氨基酸脱羧酶基因(aadc）参与完成，NRPS由6个结构域（A1-PCP1-Cy-A2-PCP2-C）组成的三个模块构成。我们运用同源建模的方法构建了模块1和模块2中A结构域的结构模型与底物结合口袋位置，并克隆表达了A1重组蛋白和A2重组蛋白，并对纯化的重组蛋白体外活性进行了研究；异源表达并纯化三个模块以及活化PCP结构域所需要的SFP蛋白(29 kDa)，对Bacillamide C合成中间体4-羧酸噻唑类似物（AlaCysthiazole）进行了体外组合生物合成，反应产物去除蛋白后浓缩并通过质谱、二级质谱鉴定，目标产物（AlaCysthiazole）与预测的中间体C6H8N2O2S (分子量172）一致。对芽孢杆菌Bacillamide C生物合成机制最直接的证据是构建突变株，文献已报道外源基因能转入芽孢杆菌属的其他菌株中，萎缩芽孢杆菌是一种顽固细菌，迄今为止，还未见萎缩芽孢杆菌接受外源基因转入的报道。在构建突变株的研究中，我们发现，该菌遗传转化困难，根据萎缩芽孢杆菌C89基因信息与已公布Bacillus属的所有质粒序列比较，发现菌株中具有内生质粒，通过基因组注释找到两套限制修饰系统, 分析可能是内生质粒和限制修饰系统阻碍外源基因转入靶细胞。经过多次外源基因转化的条件优化，已经将PRp1028质粒转入C89中，为B. atrophaeus遗传操作的研究奠定了基础。.本研究为利用组合生物合成获得Bacillamide类似物奠定基础，也为海洋天然产物的生物合成机制研究提供了依据。

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