自愈成人β地中海贫血患者γ珠蛋白基因再激活的分子机制及其遗传因素研究

The previous studies of applicant found that a few adult patients of β-thalassemia seem naturally relieved from anemia symptoms due to elevated levels of fetal hemoglobin (HbF), which may be associated with their inherited genetic modifier mutations in these patients. Further studies on the regulation mechanism of modifier genes that lead to elevated HbF level may provide new options for the treatment of severe β-thalassemia. This project aims to find the inherited modifier mutations or other genetic factors associated in these self-cure of adult β-thalassemia patients with only mild anemia by whole genome sequencing. The molecular mechanism of gamma globin gene reactivation will be further understood by comparing the gene expression profiling and the microRNA (miRNA) spectrum between CD34+ hematopoietic stem cells of self-cured adult β-thalassemia patients and normal control; then treat the K562 cells and CD34+ cells from severe β-thalassemia with miRNA and hydroxyurea, respectively, to observe the activation of γ-globin gene expression and the generation of HbF, to understand the relevant molecular signaling pathway and its regulation of the drug activation of the γ-globin gene expression, exploring a new method for drug-induced HbF for the treatment of severe β-thalassemia, and providing a basis platform for further study on the safety and efficacy of new therapeutic methods for β-thalassemia.

申请人前期研究发现极少数β地贫基因型的成年人由于胎儿血红蛋白（HbF）水平升高而自然缓解了贫血症状，可能其自身存在遗传性修饰基因突变有关。进一步研究导致HbF水平升高的修饰基因调控机制，可能为治疗重症β地贫提供新的选择。本项目拟通过对HbF升高而贫血症状较轻的自愈成人β地贫患者进行全基因组测序，寻找与其自愈相关的遗传性修饰基因突变或其它遗传因素，通过对此类患者CD34+造血干细胞的基因表达谱和微小RNA（miRNA）谱与正常对照的比较分析，进一步了解修饰基因再激活γ珠蛋白基因表达的分子机制；再分别用调控修饰基因功能的miRNA和羟基脲等药物处理体外培养的K562细胞和重症β地贫患者CD34+细胞，观察其激活γ珠蛋白基因表达、生成HbF情况，了解药物激活γ珠蛋白基因表达的相关分子信号通路及其调控方式，探索药物诱导生成HbF的治疗重症β地贫新方法，为研究β地贫治疗新途径安全性和有效性提供依据。

本项目成功构建了CD34+造血干祖细胞在体外扩增的方案，建立了人CD34+造血干祖细胞培养物，使人CD34+造血干祖细胞培养物可以在体外顺利增殖160倍以上，并诱导分化为红系，提高了体外可用CD34+造血干祖细胞的数量，并验证了扩增后CD34+造血干祖细胞的红系分化潜能。CD34+造血干祖细胞的体外扩增一直是限制CD34+造血干祖细胞应用的一大难题，并以此开展羟基脲诱导CD34+细胞γ珠蛋白基因表达的细胞模型研究，也可为重症β地贫患者的基因治疗研究提供细胞模型平台。.本项目使用不同浓度羟基脲作用K562细胞不同时间，在K562细胞株中筛选出了羟基脲诱导的最佳剂效，当羟基脲浓度为200uM、作用时间为72h时对K562细胞的HBG基因表达和γ珠蛋白生成量的诱导效果最好。使用200uM浓度羟基脲作用K562和CD34+造血干祖细胞72h后，采用实时荧光定量PCR检测γ珠蛋基因、α珠蛋白基因、β珠蛋白基因及转录因子BCL11A和MYB的表达情况。研究结果表明，羟基脲作用后的K562细胞和CD34+造血干祖细胞的转录因子BCL11A的表达受到了抑制，HBG基因表达增强，但是羟基脲作用前后对α珠蛋白基因、β珠蛋白基因和转录因子MYB的表达没有影响。采用WB检测羟基脲作用CD34+造血干祖细胞前后γ珠蛋白、α珠蛋白、β珠蛋白、BCL11A蛋白和MYB蛋白的生成量。羟基脲作用后的K562细胞和CD34+造血干祖细胞的γ珠蛋白生产量提高了1.5倍左右，BCL11A蛋白的生产量是正常细胞的一半。结果证实了羟基脲通过抑制BCL11A基因表达进而诱导γ珠蛋白的合成，该调控途径的验证为明确羟基脲诱导γ珠蛋白合成的作用机制提供了新的实验证据，为探索药物诱导的β地贫患者治疗新途径提供了新的思路，完成了预定的研究目标，主要论文稍后投稿。

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