利用超分辨显微镜揭示细胞膜上PTK7组装对癌症发生及发展的影响

Tyrosine-protein kinase-like 7 (PTK7), as a multifunctional regulator, play a crucial role in cellular motility and migration by involving in Wnt signaling. It has been reported that abnormal expression of PTK7 is associated with tumorigenesis, metastasis and prognosis of various cancers, thus as potential targets for several cancer diagnosis and treatment. However, the biological details of PTK7 at single molecular level are unclear, limited to research methods. Aptamers can be ideal small-molecular ligands, with their small volume and the ability to recognize different targets with high affinity and specificity, but their applications are mainly focused on conventional fluorescent microscopy and bioluminescence imaging. Therefore, with applying super-resolution fluorescent microscopy and a novel fluorescent probe by linking aptamer to photo-activatable fluorescent molecule, we will observe PTK7 organization on cell apical and basilar membranes, as well as the relationship between PTK7 with the classical membrane structures and common membrane molecules, which systemically characterizes PTK7 distribution; then we will find the differences in the assembly of PTK7 and the co-localization between PTK7 and the proteins related to the Wnt signaling on different types of cell membranes, promoting to reveal imparts of PTK7 organization changes on Wnt signaling, and tumorigenesis and development at single molecular level.

蛋白酪氨酸激酶-7（PTK7），作为多功能调节子，参与调控Wnt信号通路，影响着细胞的运动、迁移。虽然已报道其异常表达与多种癌症的发生、转移及预后效果有关，可作为多种癌症诊断和治疗的潜在靶点。然而，限于研究手段，PTK7相关的生物细节信息并不清晰。适配体作为短小的单链RNA/DNA，能够对不同靶标以高亲和力特异性识别，是理想的小分子探针，但对其应用多集中在普通荧光和生物发光等光学成像体系。本项目拟利用超分辨荧光显微镜，将适配体与光可激活荧光分子结合，作为新型荧光探针，观察细胞膜表面PTK7的组装特征，以及与膜上经典结构和常见分子的定位关系，系统揭示PTK7在细胞膜上的分布规律；通过观察正常细胞、低转移、高转移特性癌细胞膜表面PTK7的组装差异，及PTK7与Wnt信号通路中相关蛋白受体的定位差异，从单分子水平揭示PTK7组装改变对Wnt信号传导以及对癌症发生、发展的影响。

蛋白酪氨酸激酶-7（PTK7），作为多功能调节子，参与调控Wnt信号通路，影响着细胞的运动、迁移。虽然已报道其异常表达与多种癌症的发生、转移及预后效果有关，可作为多种癌症诊断和治疗的潜在靶点。然而，限于研究手段，PTK7相关的生物细节信息并不清晰。适配体作为短小的单链RNA/DNA，能够对不同靶标以高亲和力特异性识别，是理想的小分子探针，但对其应用多集中在普通荧光和生物发光等光学成像体系。本项目中，我们成功制备了针对PTK7的Sgc8c-TAMRA探针，并通过双色dSTORM成像和多种对照实验验证了探针的高特异性和低非特异性。通过和抗体探针标记的对比成像，揭示了适配体探针能够更准确、更高密度地标记靶标。利用此探针标记MCF10A细胞，发现PTK7在细胞顶端膜和基底膜上存在差异分布，我们推测蛋白微区域分布越显著，越有利于其高效地完成其生物功能。通过探索PTK7簇与脂筏、细胞膜微丝骨架、细胞膜外糖链之间的关系差异，揭示了顶端膜和基底膜上PTK7分布差异的内在因素。另外，我们发现PTK7在MCF10A、MCF7和MDA-MB-231表面的分布也存在差异。随着癌症的发生和发展，PTK7在细胞膜上不仅表达量下降，其成簇分布现象也明显减弱，表明PTK7蛋白簇变小、变少能够降低细胞的粘附，促进癌细胞的迁移、侵袭。我们采用Dkk-1作用MDA-MB-231，通过影响Wnt信号通路抑制细胞迁移，发现PTK7蛋白成簇现象增加，这表明PTK7蛋白参与Wnt信号通路，当其组装形态发生改变，其对细胞迁移的调节能力也发生变化。通过双色dSTORM发现MDA-MB-231细胞表面PTK7和Wnt5a蛋白和MMP14（细胞膜金属蛋白酶14）存在共定位分布，表明PTK7和Wnt5a相互作用参与Wnt信号通路调节；同时PTK7和MMP14分布在一起，PTK7能够被MMP14水解，降低在细胞膜上的分布密度和成簇现象，从而降低细胞的粘附，促进细胞迁移。对PTK7组装细节和功能之间关系的系统揭示，有利于更好地理解其在细胞癌变过程中的功能机制。

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