Akt/USP8/Nrdp1通路在TNFSF15抑制脑创伤后小胶质细胞过度活化中的作用及机制研究

Over-activated microglia-mediated brain edema and neuron damage is the main causes of traumatic brain injury-induced death and disability. Previous data has reported that Nrdp1 mediates degradation of receptor tyrosine kinase and microglia M2 polarization. VEGFR1 is one of the receptor tyrosine kinase and mediates microglia activity. Recently, it’s found that TNFSF15 is a novel VEGFR1 regulator and its receptor DR3 which mediates Akt activation is expressed in microglia. Our pre-experiment found that TNFSF15 decreases the number of activated microglia，VEGFR1 expression and alleviates TBI-induced brain edema and improve neurological function, however, the mechanism of TNFSF15 action on TBI is unclear. In this project, we will utilize SPC-TNFSF15 transgenic TBI mice and cellular model in vitro, to investigate : The targets of TNFSF15 inhibition of microglia activation in vivo, and TNFSF15 protects BBB integrity and neuron damage from affecting microglia activation in vitro; if TNFSF15 activates Akt/USP8/Nrdp1 by DR3 which triggers VEGFR1 degradation in ubiquitin-dependent proteasome pathway and M2 polarization in ubiquitin-independent proteasome pathway leading to TNFSF15 inhibition of microglia activation.

小胶质细胞过度活化介导的脑水肿和神经元损害是脑创伤(TBI)致死致残的主要原因。研究表明：Nrdp1介导受体酪氨酸激酶降解和小胶质细胞M2型极化。VEGFR1属受体酪氨酸激酶并介导小胶质细胞活性。TNFSF15是新发现的VEGFR1调控因子其受体DR3在小胶质细胞中表达并能激活Akt。本组前期发现：TNFSF15减少TBI小鼠损伤区活化的小胶质细胞数量，VEGFR1表达和水肿体积，保护神经元（见工作基础），但机制不详。本课题拟在前期工作的基础上，通过TNFSF15转基因TBI小鼠及体外细胞模型，探讨TNFSF15调控小胶质细胞过度活化的体内靶点和抑制小胶质细胞活化对体外BBB和神经元的保护作用；研究TNFSF15是否通过DR3激活Akt/USP8提高Nrdp1，调动泛素化-蛋白酶体途径调控VEGFR1表达，同时又通过泛素化-非蛋白酶体途径促进小胶质细胞M2型极化，最终抑制小胶质细胞过度活化

小胶质细胞过度活化介导的脑水肿和神经元损害是脑创伤(TBI)致死致残的主要原因。VEGFR1和VEGFR2属受体酪氨酸激酶并介导小胶质细胞活性和血管渗漏。TNFSF15是新发现的VEGFR1调控因子其受体DR3在小胶质细胞中表达并能激活Akt。在本研究中，通过探索，我们发现TNFSF15能够从两方面保护TBI引起的继发性损伤。首先，我们采用LPS和VEGF共同刺激小胶质细胞使其激活，收集其培养基，用来刺激体外血脑屏障模型和神经元细胞，结果发现TNFSF15能够抑制LPS和VEGF引起的小胶质细胞激活引发的血管渗漏增加和神经元数量减少。利用DR3中和抗体和TNFSF15的中和抗体，可以确定TNFSF15能够抑制VEGFR1表达同时促进Arg1表达，说明TNFSF15能够促进小胶质细胞发生M2型极化。VEGFR1介导小胶质细胞对VEGF的趋化性，因此我们检测了一下小胶质细胞在TNFSF15作用下的趋化性和极化特征，我们发现，TNFSF15能够抑制小胶质细胞的趋化性同时抑制M1型因子IL-6的分泌，但是促进M2型因子IL-10的分泌，说明TNFSF15能够通过DR3抑制小胶质细胞的过度活化，促进其向M2型极化，从而有利于保护血脑屏障。另外，在逐渐深入研究的过程中，我们发现TNFSF15还能够直接通过内皮细胞上的VEGFR2抑制血管渗漏，保护血脑屏障。在TNFSF15作用下，与血管渗漏相关的信号通路分子的激活均被抑制，比如PLC-γ，Akt和eNOS。利用信号通路阻断的方法，我们发现，DR3，SHP-1均参与了TNFSF15抑制的VEGFR2的去磷酸化，而VEGFR2的激活与血管渗漏呈正相关关系，说明TNFSF15通过DR3和SHP-1抑制VEGFR2的磷酸化从而抑制VEGF引起的血管渗漏。并且在免疫共沉淀和PLA实验中，我们发现了一个由TNFSF15诱导的DR3/VEGFR2/SHP-1蛋白复合体，该复合体是去除VEGFR2磷酸化的关键。通过以上实验，我们阐明了，TNFSF15能够抑制小胶质细胞过度活化，缓解脑水肿的关键点和相关的机制，为TNFSF15用于TBI治疗提供初步的理论依据。

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