黄连素对腹泻仔猪肠黏膜修复因子EGF、TGF等基因表达的影响

In our country, more than 160 million Piglets death every year , 80% of them are caused by diarrhea. Diarrheal dehydration induced water and salt metabolism and acid-base balance disorders and blood volume reduction is a major cause of death. The intestinal mucosa damage is the pathogenesis of diarrhea.Intestinal mucosal repair after diarrhea is mainly regulated by the gene expression of epidermal growth factor (EGF) and transforming growth factor (TGF),epidermal growth factor receptor(EGFR), insulin-like growth factors (IGF) and intestinal trilobites factor (ITF). On the basis of cultivating piglets intestinal epithelial cells in vitro, This project make the intestinal mucosal epithelial cell injury models by using infectious gastroenteritis virus, rotavirus, endotoxin in vitro and in vivo. The genes expression of EGF, TGF, EGFR, IGF, ITF are detected by real-time fluorescent quantitative PCR, in situ hybridization, electron microscopy techniques. Study the effect of berberine on the mucous repair genes such as EGF, TGF, EGFR, IGF, ITF express and the location in intestinal epithelial cells .Observing the intestinal morphology change rule in the process of damage and repair .in order to reveal the molecular mechanism of traditional Chinese medicine berberine treat diarrhea.

我国每年死亡仔猪约1.6亿头，其中80％由腹泻引起。腹泻脱水和酸碱平衡紊乱是导致死亡的主要原因。肠道粘膜损伤是腹泻的病理基础。多种腹泻因素造成肠道粘膜损伤后的修复受表皮生长因子（EGF）、转化生长因子（TGF）、表皮生长受体（EGFR）、类胰岛素生长因子（IGF）和肠三叶因子（ITF）基因表达的调节。 本项目在培养仔猪肠黏膜上皮细胞的基础上，拟利用传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、内毒素等方法造成仔猪肠黏膜上皮细胞的损伤。采用实时荧光定量PCR、电镜等技术，研究黄连素对损伤黏膜上皮细胞修复相关生长因子EGF、TGF、EGFR、IGF、ITF等mRNA表达的变化规律，观察肠道损伤与修复过程中的形态学超微变化规律，以揭示黄连素治疗腹泻的分子机制。本研究对丰富中兽医药理论具有重要的理论意义，为开发防治仔猪腹泻的高效中药制剂提供重要的理论支撑。

腹泻是导致仔猪死亡的主要原因。多种腹泻因素造成肠道粘膜损伤后的修复受多种细胞因子的调节。本项目主要开展了仔猪肠黏膜上皮细胞（IEC）的培养与鉴定；硫酸黄连素（BS）对IEC安全性试验；利用轮状病毒建立IEC损伤模型；采用实时荧光定量PCR方法，研究BS对受损IEC内EGF、TGF、EGFR、IGF等mRNA表达的影响；利用BS防治仔猪腹泻等研究内容。结果如下：.①成功培养鉴定了仔猪肠粘膜上皮细胞。利用仔猪肠道培养的细胞呈多角形、圆形或卵圆形，单层贴壁生长。免疫组织化学为上皮细胞，证明成功获得了仔猪肠黏膜上皮细胞。.②筛选出BS对肠粘膜上皮细胞安全剂量。试验显示BS的浓度为20μmol/L及其以下时用药组与对照组无显著差异。结果表明，硫酸小檗碱对仔猪体外培养IEC的最大安全浓度为20μmol/L。.③增殖了猪轮状病毒的增殖和测定毒价。分别筛选不同剂量的轮状病毒感染细胞，结果表明猪轮状病毒TCID50是10-4.5/0.1mL。.④成功利用猪轮状病毒对肠道上皮细胞攻毒建立细胞损伤模型。用0.2 mL（126 TCID50）猪轮状病毒对仔猪肠黏膜上皮细胞进行攻毒，既可以损伤细胞，又不至于把细胞大量杀死，能够开展后续试验研究。.⑤初步揭示BS对肠粘膜上皮细胞修复因子基因表达的影响：5μM、10μM、20μM三个浓度的BS均可以显著提高IEC中TGF-β1mRNA的表达量（p＜0.05）；预防组，BS浓度为10μmol/L 24h时，TGF-β1mRNA的表达极显著高于对照组（p＜0.01）；治疗组，BS浓度为10μmol/L 12h时，EGFR的表达极显著高于对照组（p＜0.01）；预防组，BS浓度为5μmol/L 36h时，EGF的表达极显著高于对照组（p＜0.01）；治疗组，BS浓度为10μmol/L 6h时，IGF的表达极显著高于对照组（p＜0.01）。结果表明在轮状病毒损伤的肠黏膜上皮细胞中，BS能够显著调控修复因子TGF-β1、EGFR、EGF、IGF1基因的表达，对受损肠黏膜的修复可能具有促进作用。.⑥利用BS制剂临床防治仔猪腹泻取得良好的防治效果。通过514头母猪对进行试验，BS给药组317头母猪产仔3758头，成活率93.0%，窝均活仔11.02头；对照组母猪197头，产仔2323头，成活率42.5%，窝均活仔5.01头。

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