施氏假单胞菌中新型NAD非依赖性L-乳酸脱氢酶研究

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AI项目解读

基本信息

  • 批准号：
    31170052
  • 项目类别：
    面上项目
  • 资助金额：
    56.0万
  • 负责人：
    马翠卿
  • 依托单位：
    山东大学
  • 学科分类：
    C0103.微生物组学与代谢
  • 结题年份：
    2015
  • 批准年份：
    2011
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2012-01-01 至2015-12-31

项目摘要

已报道的NAD非依赖性L-乳酸脱氢酶（L-iLDH）均以FMN为辅因子，在某些微生物L-乳酸代谢及致病过程中起重要作用。申请者基于多种微生物的比较基因组学分析与前期实验结果，推断施氏假单胞菌A1501中由lldA、lldB和lldC三个基因构成的基因簇lldABC编码一种新型多亚基蛋白，以Fe-S中心为辅因子，行使催化L-乳酸生成丙酮酸的功能。该蛋白与目前已报道的L-iLDH具有明显区别，为一种新型L-iLDH。本申请以施氏假单胞菌A1501为研究对象，克隆获得基因簇lldABC，基因敲除手段确定lldABC在施氏假单胞菌A1501 L-乳酸代谢中的关键作用；外源表达并分离纯化该新型L-iLDH，研究其基本酶学性质；生物信息学与生化分析相结合确定亚基LldA、LldB和LldC在L-iLDH催化氧化L-乳酸过程中的作用；分析该新型L-iLDH获取、传递电子过程，阐明其催化机理。

结项摘要

NAD-非依赖性L-乳酸脱氢酶(L-iLDH)在微生物L-乳酸代谢及致病过程中起重要作用。已报道的L-iLDH均为同型多聚体蛋白，以FMN为辅因子。项目组基于比较基因组学分析，推测Pseudomonas stutzeri A1501中基因簇lldABC编码一种异型多聚体蛋白LldABC，以Fe-S簇为辅因子，行使催化L-乳酸生成丙酮酸的L-iLDH功能。.P. stutzeri A1501中LldABC为膜蛋白，外源表达与分离纯化困难，项目组克隆获得lldABC，通过系统的条件优化，成功实现lldABC的外源表达，检测到L-iLDH活性；采用硫酸铵沉淀、离子交换、亲和层析等手段，得到的目的蛋白经SDS-PAGE及MALDI-TOF检测，三条条带分别与LldA、LldB和LldC相符；结合凝胶过滤色谱确定LldABC中LldA、LldB和LldC间比例为1:1:1；对LldABC的基本酶学性质及稳态动力学机制进行分析，确定LldABC催化反应遵循乒乓机制。.基因敲除、回补及酶活测定相结合，证实LldABC在菌株L-乳酸代谢中起关键作用，确定了LldABC的体内功能。lldA、lldB和lldC的敲除均会导致菌株L-乳酸代谢能力丧失，而克隆表达LldAB、LldAC和LldBC，均未检测到L-iLDH活力，证实LldA、LldB和LldC对L-iLDH功能缺一不可。吸收光谱及元素分析表明LldABC中不存在黄素辅因子，仅存在Fe-S簇，且L-乳酸脱氢过程中Fe-S簇氧化还原状态发生改变，而对LldA、LldB中Fe-S簇结合位点定点突变后LldABC的酶活明显降低。综合生物信息学、酶学以及定点突变结果，推测LldABC催化L-乳酸脱氢的机理：LldA与乙醇酸氧化酶具有同源性，以Fe-S簇为活性中心，催化L-乳酸生成丙酮酸；LldB亚基通过Fe-S簇将LldA产生的电子传递至外源电子受体；而LldC通过自身膜整合区及亚基间相互作用，将LldABC锚定于细胞膜上；三者相互配合完成催化L-乳酸脱氢同时提供电子给电子传递链产生能量的生物学功能。.本项目揭示了LldABC在P. stutzeriA1501 L-乳酸代谢过程中的具体作用，首次对该新型L-iLDH的生物学功能、生化性质与催化机理进行了系统研究；研究结果对深刻了解微生物L-乳酸代谢机制及后续致病机理分析具有重要理论意义

项目成果

期刊论文数量（16）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（0）
Production of hydroxypyruvate from glycerate by a novel biotechnological route
通过新型生物技术路线从甘油酸生产羟基丙酮酸
  • DOI：
    10.1016/j.biortech.2013.01.062
  • 发表时间：
    2013-03-01
  • 期刊：
    BIORESOURCE TECHNOLOGY
  • 影响因子：
    11.4
  • 作者：
    Gao, Chao;Wang, Xiuqing;Xu, Ping
  • 通讯作者：
    Xu, Ping
Utilization of D-Lactate as an Energy Source Supports the Growth of Gluconobacter oxydans
利用 D-乳酸作为能源支持氧化葡萄糖杆菌的生长
  • DOI：
    10.1128/aem.00527-15
  • 发表时间：
    2015-06-01
  • 期刊：
    APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY
  • 影响因子：
    4.4
  • 作者：
    Sheng, Binbin;Xu, Jing;Xu, Ping
  • 通讯作者：
    Xu, Ping
Genome Sequence of the Nonpathogenic Pseudomonas aeruginosa Strain ATCC 15442.
非致病性铜绿假单胞菌菌株 ATCC 15442 的基因组序列。
  • DOI：
    10.1128/genomea.00421-14
  • 发表时间：
    2014-05-01
  • 期刊：
    Genome announcements
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    Wang Y;Li C;Gao C;Ma C;Xu P
  • 通讯作者：
    Xu P
Efficient production of pyruvate from DL-lactate by the lactate-utilizing strain Pseudomonas stutzeri SDM.
利用乳酸利用菌株施氏假单胞菌 SDM 从 DL-乳酸高效生产丙酮酸
  • DOI：
    10.1371/journal.pone.0040755
  • 发表时间：
    2012
  • 期刊：
    PloS one
  • 影响因子：
    3.7
  • 作者：
    Gao C;Qiu J;Ma C;Xu P
  • 通讯作者：
    Xu P
An artificial enzymatic reaction cascade for a cell-free bio-system based on glycerol
基于甘油的无细胞生物系统的人工酶促反应级联
  • DOI：
    10.1039/c4gc01685h
  • 发表时间：
    2015-01-01
  • 期刊：
    GREEN CHEMISTRY
  • 影响因子：
    9.8
  • 作者：
    Gao, Chao;Li, Zhong;Xu, Ping
  • 通讯作者：
    Xu, Ping

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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

        graph TD
          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
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          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
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          K --> L[研究结束]
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