基于Cre/loxP系统诱导重组cccDNA、发展乙肝病毒持续感染小鼠模型

Covalently closed circular (ccc) DNA is an essential component of the HBV replication cycle and is regarded as a primary molecular mechanism for HBV persistence. Investigators in the field have used linear HBV DNA replicons with overlength genome for transfection to ensure the transcription of HBV mRNAs. However, the linear HBV replicon with foreign-sequence inserted may not fully surrogate the authentic cccDNA template in HBV virology, and is likely to cause distinct host immune responses. We hereby propose to induce a recombinant (r) cccDNA through Cre/loxP-mediated DNA recombination. A loxP-chimeric intron is specially engineered into the viral genome to enable functionally seamless DNA recombination. This chimeric intron could be spliced from RNA transcripts without interrupting the HBV life cycle. In the study, we plan to construct a precursor plasmid (prcccDNA) or the adenoviral vector encoding the rcccDNA sequence (prcccDNA). Hydrodynamic injection of prcccDNA or intravenous infusion of rAd/rcccDNA to Alb-Cre transgenic mice would result in accumulation of nuclear rcccDNA in the host liver. Our study will focus on how to develop rcccDNA-based HBV persistence and immunopathogenesis in the immunocompetent mouse model. Virological and immunological assays will be performed for understanding the molecular mechanism of HBV persistence. Our study will also make efforts to establish a model system in vitro and in vivo for evaluating antiviral treatments directly targeting HBV (r)cccDNA.

共价闭合环状DNA（cccDNA）是乙肝病毒（HBV）慢性感染的分子基础。HBV研究中多采用基因组串联重复、或部分重复的线性DNA复制子起始病毒复制周期，被认为可能具有与天然cccDNA模板不同的病毒学特征和宿主反应性。本项研究中，我们拟通过Cre/loxP介导的位点特异性重组策略诱导HBV 重组cccDNA（rcccDNA）。由于HBV基因组高度压缩，我们在单拷贝基因组中插入一段外源内含子序列，以容纳DNA重组残留的loxP位点；外源内含子在病毒RNA转录过程中被有效拼接，并不干扰正常的HBV复制和表达。我们将应用尾静脉高压注射rcccDNA前体质粒，或构建腺病毒载体携带rcccDNA前体序列感染免疫功能正常的Cre转基因小鼠，发展基于rcccDNA的病毒持续感染和慢性炎症模型，对HBV特征性的慢性病理机制进行深入研究；同时，建立以(r)cccDNA为靶标的抗病毒药物体内、体外评价系统。

共价闭合环状DNA（cccDNA）是乙肝病毒（HBV）慢性感染的分子基础。我们在前期研究中报道了一种通过Cre/loxP位点特异性重组诱导HBV 重组cccDNA（rcccDNA）的策略。rcccDNA能够在肝细胞核中大量诱导产生，因此能够作为一种有用的替代分子进行HBV cccDNA相关研究。应用rcccDNA模型系统，我们发现Cullin-RING泛素化连接酶4（CRL4）能够在体外培养肝肿瘤细胞系中，不依赖HBx直接上调HBV抗原的分泌表达。我们的研究显示这一效应与肿瘤细胞系快速增殖特征密切相关，这一发现将有助于我们准确理解HBx和CLR4在HBV病毒学中的生物功能。在本项课题中，我们同时基于PhiC31重组酶诱导表达系统，建立了一种在大肠杆菌中诱导HBV rcccDNA（rcccDNAattR）微环产生和纯化的策略。与常规构建的HBV基因组编码质粒相比，体内重组的rcccDNAloxP或体外重组的rcccDNAattP通过尾静脉高压水注射，均能在免疫健全小鼠体内诱导短暂延长的HBV抗原血症，显示rcccDNA具有显著的内在稳定性。我们进一步的研究发现，rcccDNA能够在免疫健全小鼠体内，在模拟慢性肝炎效应的条件下获得长期的持续表达。一方面，机体抗病毒免疫的状态决定是否能够高效地清除rcccDNA；另一方面，病毒学因素同样对rcccDNA稳定性具有重要作用。应用腺病毒载体投递rcccDNA能够在小鼠模型中诱导rcccDNA长期显著的持续表达，值得指出的是，病毒持续表达进一步诱导了慢性肝炎和进行性肝脏病理损伤。因此，本项研究基于HBV重组cccDNA成功建立了一种病毒持续感染和慢性炎症的实验小鼠模型。该研究将有助于对 HBV 持续感染和相关疾病过程的理解，同时也代表了一种重要体内实验模型系统进行抗毒药物筛选和评价。

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