HSV1减毒株M6在溶瘤治疗中的免疫模式及其机理研究

The anti-programmed cell death receptor 1 (PD-1) monoclonal antibodies have shown favorable clinical activities as anti-tumor agents regarding the regulation of immune response. The strategy of tumor immunotherapy by blocking PD-1 further suggests that interactions between ligands and receptors are likely to possess a vast potential in tumor treatment. Being a specific virus that contains multiple envelope glycoproteins to bind to various cell surface receptors, herpes simplex virus (HSV) can act as a vector appreciable for targeted delivery of drugs to improve tumor therapeutic index. Based on the establishment of a HSV1 strain with well-defined attenuate phenotype, we have constructed a mutant strain M4, in which the PD-1 dominant negative receptor (PDR), a PD-1 antagonist, was designed to replace the HVEM molecule-binding domain in glycoprotein D. This study is to construct a mutant strain M6 via modifying the genes associated with immune escape. More importantly, by exploring the role of PD-1 DNR in the process of M6 locating into tumor cells, our aim is to investigate the possible mechanism of the oncolytic effect of strain M6. This study may provide foundation for the application of the immunomodulatory-oncolytic technique in tumor therapy.

抗程序性死亡受体1（PD-1）类单克隆抗体作为以免疫模式调控为中心的抗肿瘤药物，已在临床治疗中显示出其重要的潜力。基于这一受体功能阻断而实现肿瘤细胞杀伤效应的策略，进一步提示了配体-受体相互作用概念的拓展对肿瘤治疗原理的补充。单纯疱疹病毒（HSV）作为一个具有多个表面糖蛋白，并能够与不同细胞表面受体结合的特殊病毒，能够为受体-配体结合以在肿瘤免疫调控中发挥作用提供空间。我们在具有明确减毒特性的HSV1毒株的基础上，利用PD-1的拮抗物PD-1显性负性受体(DNR)替换了HSV1表面糖蛋白gD中与免疫细胞结合且具有免疫抑制作用的HVEM分子结合域，构建了减毒株M4。本研究拟对M4毒株中与免疫逃逸密切相关的基因进一步予以缺失突变，获得突变株M6；随后对M6通过调节免疫杀伤效应，并可借助PD-1DNR进入肿瘤细胞发挥溶瘤作用的可能机理进行深入的探讨，为研究免疫调控-溶瘤作用的技术可能提供资料。

单纯疱疹病毒（herpes simplex virus, HSV）感染导致的口唇、角膜和生殖器疱疹以及重症疱疹性疾病是威胁人类健康的一类疾病，该病毒在各个年龄段人群中都具有较高感染率。由于其复杂的结构和对宿主细胞及免疫系统的特殊干扰作用，目前尚无疫苗产品进入市场。在前期的工作中，我们利用CRISPR-Cas9技术对病毒转录调控基因UL7、免疫逃逸相关基因UL41和潜伏感染相关基因LAT进行缺失突变修饰获得了具有明显减毒活性的HSV1减毒株M3。在本项目的研究工作中，我们进一步对HSV1基因组中的与抑制调亡相关的Us3和Us5基因进行缺失突变构建了突变株M5；对HSV1基因组中的Us3和抑制抗原递呈的Us12基因进行缺失突变构建了突变株M6；对HSV2基因组中的神经毒力因子RL1和潜伏感染相关LAT基因进行缺失修饰，构建了RL1-HSV-2和RL1-LAT-HSV-2突变株。针对M5 和M6毒株的生物学特性和免疫原性分析提示，M5和M6毒株感染小鼠后均不会导致小鼠的异常临床表征，两个毒株均能够诱导以血清中和抗体升高为特征的体液免疫和以干扰素-γ（interferon-γ, IFN-γ）特异性T淋巴细胞增殖为特点的细胞免疫反应。且两个毒株在小鼠或恒河猴模型中表现出针对HSV1感染的免疫保护效率。同样的，RL1-LAT-HSV-2突变株也表现出在细胞水平的低增殖能力和动物模型上的低毒力。同时，我们利用HSV2感染患者恢复期血清对HSV2病毒编码蛋白进行识别，并通过质谱鉴定发现多个核衣壳蛋白可以被临床患者恢复期血清识别。其中，UL26.5编码蛋白免疫小鼠后可诱导产生HSV2特异性的以IFN-γ和白细胞介素4（interleukin 4, IL-4）特异性T淋巴细胞增殖为特点的细胞免疫以参与机体的抗病毒反应。本研究工作成功构建了三株具有明确减毒表型和免疫原性的HSV减毒突变株，筛选到了多个可能参与宿主抗病毒免疫反应的HSV2病毒编码蛋白，为HSV1和HSV2的预防性疫苗包括减毒活疫苗以及蛋白疫苗的研发提供了思路和技术参考。

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