大鼠骨骼肌快肌纤维和慢肌纤维NMJ功能与年龄相关的变化及其影响因素分析

With advancing age,the neuromuscular junction (NMJ)of fast skeletal muscle fiber is more predisposed to the degeneration than that of slow one and fast muscle fiber also shows more severe atrophy, but the mechanism underlying the differential changes is uncertain.The recent research confirmed that the levels of NT-4 and Agrin in NMJ played an important role in maintaining the structural and functional integrity of NMJ while the accumulation of oxidative damage aggravated the degeneration. SMN (survival motor neuron) protein has a leading effect on the axoplasmic transport of motor neuron and the decline of axoplasmic transport bears a close relationship with the atrophy of skeletal muscle fiber. So we propose that the differential levels of NT-4, Agrin and their receptors in NMJ, the variable levels of SMN protein closely correlated with axoplasmic transport, combined with the different cumulation of oxidative damage in NMJs between fast and slow skeletal muscle fibers, contribute to the distinct degeneration of NMJs between two types of muscle fibers. The detections of electrophysiology, real-time quantitative PCR, Western blot, gas chromatography-mass spectrometry are applied to analyze the actions of above-mentioned factors and potential interactions among them leading to the differential degeneration of NMJs will be examined. The result will shed some light on the mechanism responsible for the difference of degeneration in NMJs between fast and slow muscle fibers. It is also conducive to finding the therapies or interventions for retarding, preventing or even inverting the development of sarcopenia.

随年龄增长，骨骼肌快肌纤维的神经肌肉连接(NMJ)较慢肌纤维更易发生退变，快肌纤维萎缩也更明显，但其形成机制尚不明确。既往研究证明，NMJ处NT-4、Agrin水平与NMJ结构和功能完整性密切相关，而氧化损伤的蓄积则会促使其退变；SMN蛋白在运动神经元的轴浆运输中起关键作用，轴浆运输能力下降与骨骼肌纤维的萎缩程度相关。由此，本项目提出快肌纤维和慢肌纤维NMJ处Nt-4、Agrin及其受体、影响支配二者运动神经元轴浆运输的重要SMN蛋白以及NMJ处氧化损伤蓄积的水平不同，导致两种肌纤维的NMJ发生差异退变。本研究通过电生理学、实时荧光定量PCR和Western Blot、气相色谱-质谱法等多种实验手段，分析上述因素在两种肌纤维NMJ差异退变中的作用及其可能的相互影响，以明确衰老所致的两种肌纤维NMJ差异退变的可能机制，这对于发现延缓、阻止或逆转骨骼肌减少症发生的相关治疗措施具有重要意义。

随年龄增长，骨骼肌质量和功能出现进行性下降，称为骨骼肌减少症。研究表明，骨骼肌减少症的形成是多因素共同作用的结果，骨骼肌纤维脱神经支配在其中发挥重要作用，而神经肌肉接头（NMJ）是运动神经元和骨骼肌之间联系的枢纽。早期研究表明，骨骼肌快肌纤维较慢肌纤维更易发生脱神经支配，本研究目的即是探寻二者NMJ差异退变的原因，以期为骨骼肌减少症的干预提供新的方向。. 本研究通过细胞内电生理检测、qPCR、Western Blot、ELISA生化检测等技术手段，检测和分析了SD大鼠趾长伸肌（EDL，典型快肌纤维）和比目鱼肌（So，典型慢肌纤维）NMJ处的神经-肌肉传递功能及对维持NMJ结构和功能完整性发挥重要作用的NT-4及其受体TrkB和p75NTR、Agrin/MusK通路主要调控因子及参与运动神经元轴浆运输的SMN的mRNA及蛋白水平在肌肉及其支配神经内随年龄增长而发生的变化。结果表明，神经-肌肉传递功能及维持NMJ稳定性的NT-4及其受体TrkB、Agrin、MusK和SMN水平整体呈下降趋势，而促使细胞凋亡的p75NTR水平升高，差异主要体现在幼年和青年SD大鼠与老年早期和老年晚期组间，提示NMJ的传递功能及稳定性随年龄增长而降低，尤其是在老年期，这易致骨骼肌纤维出现脱神经支配，但同年龄组EDL和So及其支配神经内上述因素比较，其差异没有一致性规律可循。. 此外，EDL和So及其支配神经内SOD总含量、CuZnSOD及MnSOD含量检测显示，上述抗氧化物水平随年龄增长呈下降趋势，同年龄组EDL及其支配神经内上述抗氧化物水平普遍高于So及其神经；对不同年龄组EDL和So及其支配神经内蛋白质、脂质和DNA氧化损伤标志物Carbonyl、F2-isoprostanes和8-OhdG浓度检测发现，这些大分子的氧化损伤水平随年龄增长呈加重趋势，同年龄组EDL和So及其支配神经内上述标志物水平差异显著，提示生物大分子氧化损伤水平差异可能是导致EDL和So的NMJ差异退变的主要原因。

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