近端结合CRISPR探针构建及细胞核基因点突变直接成像研究

The ability for profiling single-nucleotide variation (SNV) in situ in single cells or intact tissues would allow us to delineate the molecular portrait of single cells in more details. However, since nuclear genome is strictly packed with histones in a highly condensed nucleosome structure, it’s still challenging to analysis SNVs inside chromatin. In this project, we plan to use CRISPR-based probes for detection of SNVs in nuclear genome. Using a proximal binding induced hyperbranched hybridization chain reaction to amplify the signal, we aim to image the wild type and mutated gene at same time in situ in single cell nucleus. Firstly, a new strategy of proximal dCas9/sgRNA probes binding is proposed to recognize the SNVs in double-stranded DNA. By strategically designing the sgRNA, we can efficiently modify the dCas9/sgRNA complex with nucleic acid probes, increase the detection specificity and extend the range of targeted sequences. Secondly, a proximal binding induced non-enzymatic isothermal amplification method is developed for fluorescent imaging of targeted SNVs at single-molecular level in cell nucleus. Finally, probes for different SNVs will be designed and tested to summarize the principle of probe design. The designed probes will be used for circulating tumor cell, tissue section and multicellular spheroids analysis to study the relationship between a cell’s genotype and behavior, providing a platform to analysis of single cell heterogeneity.

单细胞水平的细胞核基因点突变直接成像可以为疾病诊断和复杂生物体系的分析提供重要的分子信息。然而，由于细胞核中的DNA双链被组蛋白紧密压缩和包裹，目前基于寡核苷酸探针的成像方法较难实现对细胞核基因点突变的高灵敏分析，需要发展新型的分子识别工具和适用于细胞核环境的信号扩增手段。本项目拟设计基于CRISPR系统的新型分子识别探针，利用dCas9/sgRNA复合体高效的DNA双链结合能力和高特异的单碱基差异识别能力，实现细胞核内基因点突变的精准识别；并通过近端结合策略诱导高灵敏的信号转化，引发支化的杂交链式反应，在细胞核的致密复杂环境中实现高效信号扩增和单分子级基因点突变原位荧光成像。最后，利用模块化的探针设计原理，针对不同基因位点构建一系列荧光成像探针，进一步总结探针的设计原则和规律，并应用于多种生物样品的直接成像分析，探索细胞基因型与单细胞行为之间的关系，为单细胞异质性研究提供有效的技术平台。

细胞核基因点突变的原位成像分析对疾病诊断和复杂生物体系分析有重要意义。本项目针对细胞核基因点突变直接成像问题，发展了多种基于CRISPR系统的生物探针构建策略，并用于肿瘤细胞、活细菌和细胞分泌外泌体中的核酸信息成像。取得的主要研究成果有：1）发展了双工程化CRISPR探针共定位策略，系统研究了该策略对细胞核中不同基因突变位点的成像特异性和成像效率，实现了细胞核基因野生型和突变型的同时高效成像。2）利用引物链交换反应（PER）的可编程信号放大能力，发展了一种新型 CRISPR/Cas9 探针介导的信号放大策略，用于细胞核中目标基因低重复序列和非重复序列区域的可编程原位成像。3）发展了一种数字化外泌体表面蛋白原位成像分析方法，成功实现对癌症患者血浆样本中CD63/EpCAM/MUC1三阳性外泌体的超灵敏免分离检测。4）探究了引物链交换反应（PER）在外泌体单颗粒表面蛋白信号扩增中的应用，精准分析了肿瘤外泌体表面PD-L1蛋白表达，并用于临床乳腺癌血浆样品分析及动物模型的免疫治疗疗效预测。5）发展了基于CRISPR系统和环状报告探针的一体化纳米探针，用于活细菌中耐药基因的实时成像。在本基金的资助下，项目负责人以第一/通讯作者在Chem. Soc. Rev., Nano Lett., CCS Chemistry, Chem. Sci, Small, Anal. Chem., 等期刊发表论文12篇，获批国家自然科学基金优秀青年基金项目1项。该项目的相关研究成果可为细胞原位基因突变成像技术的发展提供新的策略和方案。

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