环二核苷酸阳离子脂质体载体系统的构建及其免疫刺激活性研究

Cyclic dinucleotides (CDNs) is an endogenous second messenger in both bacteria and higher organisms (more recently, in mammalian cells), which pay important functions in the immune response to intracellular DNA in antiviral innate immune signaling pathway. Studies on the bio-functions of CDNs and the discovery of CDNs-based immunotherapy drug have has become research hot topic at home and abroad. However, CDNs can be easy to be decomposed by several nucleases or phosphodiesterases inducing the low in vitro and in vivo stability and low bioavailability, this issue should be addressed and improved. In this proposal, biodegradable cationic lipids will be designed and synthesized to deliver the CDNs and to enhance their in vitro and in vivo stability, the immunostimulatory activity and bioavailability. The transfer efficiency, bio-safety, targeting assay, and immunostimulatory activity of those cationic lipids CDNs delivery system will be systematically investigated. This study will enhance the comprehension and recognization of the function of CDNs paid in infectious diseases and autoimmune diseases, also will promote the development of CDNs-based immunotherapy drug.

环二核苷酸是生物体的第二信使，在生物体中发挥着重要的信号传递作用。基于环二核苷酸的生物功能研究以及相关免疫治疗药物的开发，已成为目前国内外研究的热点领域。然而，环二核苷酸在体内可被多种核酸酶和磷酸二酯酶降解，存在着体内稳定性差、生物利用度低等问题。本项目拟设计、合成生物可降解的阳离子脂质体，用作环二核苷酸载体，以提高环二核苷酸在体内外的稳定性和生物利用度。系统地研究阳离子脂质体环二核苷酸载体系统的转运效率、生物安全性和靶向性，同时对环二核苷酸载体系统对免疫刺激活性能的增强能力和体内外的治疗效果进行评价。项目研究将提升对环二核苷酸在感染性疾病和自身免疫性疾病中作用的理解和认识，对相关免疫治疗药物开发具有重要的推动作用。

环二核苷酸可激活cGAS-STING信号通路，在肿瘤免疫治疗中发挥重要的作用。由于外源性环二核苷酸的膜渗透性差，且在体内可被多种核酸酶和磷酸二酯酶降解，存在着体内稳定性差、生物利用度低等问题。因此，如何构建高效、安全的载体系统将外源性环二核苷酸导入机体、靶细胞、或组织，是基于环二核苷酸肿瘤免疫治疗的关键。本项目构建了一系列基于阳离子脂质体和阳离子多肽纳米管的环二核苷酸载体系统，用于外源性环二核苷酸的递送，以提高环二核苷酸在体内外的稳定性和生物利用度。系统地研究环二核苷酸载体系统的转运效率、生物安全性，同时对环二核苷酸载体系统对免疫刺激活性能的增强能力和体内外的治疗效果进行评价。主要研究内容包括：① 实现了环二腺苷酸(c-di-AMP)和环二鸟苷酸(c-di-GMP)小规模合成；② 构建了一系列不同化学结构与物理结构的阳离子脂质体共65个化合物；③ 以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为递送对象，对季戊四醇类阳离子脂质体的转染活性进行了详细的研究；④ 以四氯化碳诱导小鼠急性肝损伤模型，进一步证实了甘二脂质体(英文缩写HEDMA-Apd-di-C12)具体高转染活性、肝靶向性和良好的生物安全性；⑤ 以环二鸟苷酸(c-di-GMP)为递送对象，构建近、远端小鼠黑色素肿瘤模型，采用肿瘤原位给药和尾静脉注射给药治疗方式，对HEDMA-Apd-di-C12阳离子脂质体载体系统和PNT、PPNT、TP-2、RP-3等多肽纳米管载体系统转运c-di-GMP性能、肿瘤免疫治疗活性与机制、生物安全性进行了评价与研究。研究结果表明载体系统能有效递送c-di-GMP，增强了STING、p-STING蛋白以及INF-a、TNF-b、IL-6和IL-1β等细胞因子的的表达，使CD4和CD8的表达上调，激活了T细胞杀伤肿瘤细胞的免疫反应，导致肿瘤的生长受到抑制，且各载体系统的生物安全性良好。研究结果对提升对环状二聚核苷酸在感染性疾病和自身免疫性疾病中的作用的理解和认识，促进外源性环二核苷酸易被酶降解、体内外稳定性差和生物利用度低这一科学问题的解决，推动了以环二核苷酸为基础的免疫治疗药物的开发与应用。

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