窒息死亡特异性microRNA标志物和死亡时间推断内参指标的鉴定

The estimation of asphyxia and the postmortem interval are the difficult and hotspot areas all the time. Currently, more and more published papers mentioned that the methods of using fluorescence quantitative PCR detection of the housekeeping gene mRNA levels to estimate postmortem interval. In the previous study, we had used sacrificed rat model to build up the spline function. However, the accuracy of this method largely depends on the stability of the internal reference genes. Meanwhile, we found that the mRNA levels of housekeeping genes vary widely in different causes of death. MicroRNA is a short-chain molecules, having considerable stability from degradation after death. In this study, using miRNA microarray, we will focus on human samples, detecting the hypoxia-sensitive brain tissues, to identify microRNA markers of asphyxia and reference marker of postmortem interval. We set up the mechanical asphyxia as the experimental group, traumatic brain injury, hemorrhagic shock and sudden death as different death caused control groups. The purpose of this study are screening the special changes of miRNA (such as extraordinarily high or low levels of miRNA) as indicators of asphyxia to speculate the cause of death and screening stable miRNA as the internal reference marker in the estimating of postmortem interval, these parameters will ultimately be used on the optimizing of our previous buildup postmortem interval spline function. The target genes of these miRNA will be identified and validated,to elucidate the mechanisms of the miRNA expression changes in hypoxia caused asphyxia and death. Our study will provide new insight for analysis the cause of death of mechanical asphyxia and the estimating of postmortem interval.

窒息死亡原因分析和死亡时间推断一直是法医学研究的重点和难点。近年来，利用荧光定量RT-PCR检测管家基因mRNA水平来分析死因和进行死亡时间推断已逐渐成为研究热点。我们前期利用建立的大鼠断颈处死模型获得了推测死亡时间的样条函数方程，但发现其精确性很大程度上依赖于稳定的内参指标；同时，发现不同死因的管家基因mRNA的水平差异很大。MicroRNA作为短链小分子，性质稳定，不易降解。本课题拟利用miRNA表达谱芯片，以人体样本为研究材料，将机械性窒息作为实验组，颅脑损伤、失血性休克和猝死作为不同死因的对照组，通过检测对缺氧敏感的大脑组织，分别筛选出差异明显的miRNA作为窒息死亡原因推测的指标，并通过靶基因的确定和验证，明确缺氧与miRNA表达变化之间的机制，最终将之应用于窒息死亡原因推测；同时，筛选出表达稳定的miRNA作为死亡时间推断的内参指标，用于进一步优化已有的推测死亡时间的样条函数。

机械性窒息死亡是法医病理学中一大类死亡，因其缺乏特异性标志物，死因诊断只能是“符合性”。找到窒息死亡特异性标志物具有重要的法医学意义。目前推断机械性窒息死亡的研究较少，一般只针对单个或少数几个mRNA或蛋白指标，未涉及miRNA的研究，部分研究仅限在动物实验，未在人体样本验证。.本课题通过高通量miRNA芯片分析技术检测不同死因的人体组织的miRNA的表达、大量人体样本验证以及排除性别、年龄、环境温度和死亡时间的影响，发现了一批机械性窒息组对比颅脑损伤组、失血性休克组和其他死因组有显著性差异的指标，并对某些指标进行了深入研究，找到了其在机械性窒息组差异表达的可能机理。我们在研究过程中增加了mRNA指标的筛选，为窒息死亡的死因诊断提供了更多的指标。.研究成果如下：（1）通过对人体样本进行高通量miRNA芯片表达谱检测及RT-qPCR的定量，挑选出了组织特异性的适合进行机械性窒息死因推断的指标，机械性窒息对颅脑损伤及失血性休克有差异性表达的miRNA：脑组织中有miR-1246、miR-1250；心肌组织中有miR-122-3p、miR-1228、miR-3185等。同时也挑选出了在两种组织中均适合进行机械性窒息死因推断的指标，如miR-122、miR-1281。（2）通过用RT-qPCR、Western Blot及双荧光素报告基因对特异性下调的mir-122的靶基因验证后发现，ALDOA、G6PC3及CS在mRNA和蛋白水平均呈上调趋势。这3个靶基因是葡萄糖无氧酵解及有氧氧化等糖代谢的关键酶，表明机械性窒息特异性下调表达的mi-122可能通过调控靶基因ALDOA、G6PC3及CS等糖代谢关键酶的上调来参与机械性窒息死亡进程中的葡萄糖代谢及能量代谢调控。（3）通过RefFinder内参评估软件，发现在所有人体样本中稳定性最高的18sRNA适合作为内参指标。（4）通过mRNA芯片检测及定量分析，找到心肌组织中机械性窒息对比颅脑损伤及失血性休克均有差异性表达的mRNA有DUSP1和KCNJ2，可以作为心肌组织中特异的指标。.本研究具有较大创新性，找到一批机械性窒息死亡的特异性指标，并对某些指标进行了机制研究，为机械性窒息死亡诊断提供了理论依据，有望解决困扰法医学界的机械性窒息死因诊断问题。

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