茶尺蠖产卵引诱信息素降解酶的鉴定及功能研究

The sophisticated olfactory system plays important roles for lepidopteran moth species to detect oviposition-attractant pheromones and locate oviposition sites. In the olfactory cues transduction pathway, the rapid degradation of oviposition pheromones is crucial to restore the sensitivity of the sensory neuron after their activations of odorant receptors. In the current project proposal, we mainly focus on the antennal enriched carboxylesterases (CXEs) with particular interests to identify and functionally characterize the oviposition-attractant pheromone degrading enzymes, OPDEs related to E. obliqua oviposition behaviors. First, quantitative real-time PCR experiment is used to evaluate the CXEs transcript level variations under the exposure to the oviposition-attractant pheromones. Next, the chemosensillum localization of CXEs in female oviposition pheromones-sensitive sensilla will be studied by using in situ hybridizations, immunocytochemistry and the single sensillum recording assay. Finally, enzyme activities and kinetic estimations in vitro in combination with RNA interference in vivo are employed to investigate the substrate spectrum, functional evolution and the physiological roles of CXEs in degrading the oviposition-attractant pheromones of female E. obliqua moth. The results would provide new insights on the molecular mechanisms of insect olfactory cue degradation, which in turn help to develop the new environmentally friendly pest-management strategies to regulate female E. obliqua egg-laying behaviors through RNAi with CXEs as target.

蛾类昆虫高度灵敏的嗅觉系统对其识别产卵信息素、定位产卵位点至关重要。在嗅觉信号的传递通路中，气味受体被激活后，产卵信息素的及时清除有助于快速恢复嗅觉神经元的敏感性。本项目拟以茶树重要害虫茶尺蠖为研究对象，基于前期成功鉴定雌蛾酯类产卵信息素的研究基础，拟重点研究触角高表达的羧酸酯酶CXEs，以期鉴定茶尺蠖产卵信息素降解酶OPDEs并阐明其在雌蛾偏好产卵中的生理功能。首先，利用荧光定量PCR分析触角酯酶CXEs的底物诱导表达谱；其次，通过原位杂交、免疫组化和单感器记录研究CXEs在茶尺蠖雌蛾产卵信息素敏感感器中的定位。最后，结合体外酶动力学及活体水平RNAi系统的阐明CXEs的底物谱、功能进化及在降解茶尺蠖产卵信息素中的生理功能。研究结果一方面有助于解析昆虫嗅觉信号降解的分子机制，同时也为探索利用OPDEs靶向调控茶尺蠖产卵行为，研发相应的绿色防控技术提供科学依据。

茶尺蠖是我国茶园重要的鳞翅目害虫，严重危害我国茶叶的安全生产。研发该害虫的绿色防控技术，降低化学农药的使用对于贯彻落实绿色低碳生态理念，保障茶叶品质安全至关重要。化学通讯系统在鳞翅目蛾类昆虫感受外界信号，定位产卵位点中挥发重要作用，触角酯酶CXEs被报道广泛存在于蛾类昆虫的化学通讯系统，起到降解气味信号以及外界有害物质，迅速恢复嗅觉系统敏感性的重要作用。本项目以茶园重要害虫茶尺蠖为研究对象，着重解析茶尺蠖触角酯酶EoblCXEs在降解产卵信号中的生理功能。项目首先验证了挥发物Z3- 6：Ac和Z3- 6：He对茶尺蠖的产卵偏好，进一步明确了Z3- 6：Ac和Z3- 6：He可作为茶尺蠖产卵引诱信息素的活性组分。通过荧光定量qRT-PCR分析了触角酯酶基因EoblCXEs在雌蛾产卵前后表达量的差异，明确了EoblCXE4、EoblCXE5、EoblCXE13、EoblCXE21、EoblCXE27， EoblCXE29，EoblCXE34在茶尺蠖嗅觉器官（头部-触角）中的高表达以及在产卵前后的表达量差异。进一步组织特异与发育适龄表达分析表明，EoblCXEs在各发育时期广泛表达，且不同EoblCXEs基因在各组织的表达丰度不同。通过构建触角酯酶EoblCXEs蛋白模型与分子对接，分析了EoblCXE4、EoblCXE5、EoblCXE13、EoblCXE21、EoblCXE27，EoblCXE29，EoblCXE34与产卵信息素等化合物的结合能力与功能位点，结果表明EoblCXE4、EoblCXE21结合产卵信息素Z3- 6：Ac和Z3- 6：He的能力较强，EoblCXE13、EoblCXE34结合能力次之，EoblCXE27、EoblCXE29，EoblCXE5、EoblCXE34结合能力较弱。氢键和疏水作用力是EoblCXE4，EoblCXE21结合Z3- 6：Ac和Z3- 6：He的关键作用力。项目成功建立以EoblCXEs为靶向的RNAi技术体系，在雌蛾与幼虫中成功干扰了EoblCXE27，有效提高了茶尺蠖幼虫对茶园常用农药联苯菊酯的敏感性，项目提出茶尺蠖可能通过高表达EoblCXE27降解有害外源物，保护嗅觉系统的敏感性进而调控其产卵行为的推论。项目研究结果为建立以触角酯酶为靶向的害虫行为调控体系，研发相应的绿色防控技术提供了理论依据。

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