类泛素蛋白FAT10在肥厚型心肌病致室速中调控RyR2蛋白的分子机制

Aberrant cardiac ryanodine receptor (RyR2) of sarcoplasmic reticulum is one of major pathyphysiologies in remodeling of hypertrophic cardiomyopathy. Ubiquitin-like proteins belong to post-translational modification of protein, which have become a hot-point in the field of cardiovascular research. Until now, it is unknown whether RyR2 is modulated by ubiquitin-like proteins. Our published data showed that the apoptosis induced by hypoxia/reoxygenation stress in cardiomyocytes was reduced by overexpression of ubiquitin-like protein FAT10, and our preliminary data showed that overexpression of FAT10 could increase the expression of RyR2 but the exact mechanism was unclear. A regulator upstream of RyR2, CaMK2d (a subunit of CaMKII), might be a substrate of FAT10. This study will focus on the direct interaction between FAT10 and CaMK2d by molecular analysis, and try to explore how FAT10 modulates RyR2 through CaMK2d by using FAT10 knockout mice with load-induced ventricular hypertrophy model.

心脏肥厚性重构引起恶性室性心律失常的主要病理生理改变之一，是肌浆网钙释放蛋白RyR2数量和功能异常。蛋白质翻译后修饰形式-类泛素化，是近年的研究热点。心肌肥厚致室速过程中RyR2是否受类泛素蛋白调控及其机制均未知。我们的前期研究首次报道在心肌细胞中过表达FAT10可减少缺氧/复氧引起的凋亡。前期预实验显示，心肌细胞过表达FAT10使RyR2升高，但具体机制不明。RyR2上游一个重要调控蛋白CaMKII亚单位CaMK2d被发现很可能是FAT10的作用底物。本研究拟利用免疫共沉淀、共聚焦等技术，在心肌细胞证实FAT10与CaMK2d的直接相互作用，探寻FAT10通过CaMK2d如何调控RyR2。构建FAT10敲除小鼠和压力负荷心脏肥厚模型，结合分子生物学及电生理技术，从体内外水平探索FAT10-CaMK2d-RyR2通路参与心肌肥厚继而发生电生理紊乱的调控机制。

背景：FAT10是最近报道在心脏组织中表达的一种类泛素蛋白。然而它在心肌肥厚性重构的发病过程中的作用仍旧未知。因此我们研究了FAT10对心肌肥厚的生物学影响以及潜在的作用机制。.方法与结果：不论在自发性高血压或主动脉缩窄（TAC）诱导的体内心肌肥厚模型还是在血管紧张素II（AngII）诱导的原代心肌细胞肥大模型中，FAT10的表达均被下调。随之，我们构建了心脏组织特异性FAT10敲除小鼠，并进行4周TAC诱导心肌肥厚实验。结果发现，在TAC造模之后，与对照小鼠相比，FAT10基因敲除能够明显降低小鼠生存率并加重心肌肥厚与心肌纤维化。此外，过表达FAT10可以减轻AngII诱导的体外心肌细胞肥大反应。通过蛋白组学筛查我们发现CaMK2D是FAT10的一个潜在的相互作用蛋白，随后利用免疫共沉淀与共定位实验验证了两个蛋白的相互作用。腺病毒外源性的过表达FAT10能够抑制CaMK2D对RyR2特异性的磷酸化，并同时抑制肌浆网钙释放水平。相应的敲低FAT10则对心肌细胞具有相反的作用。进一步我们发现心肌细胞中过量的FAT10可以轻微的下调CaMK2D的表达，但并不通过泛素-蛋白酶体途径调控其蛋白降解。FAT10可以直接地、特异地结合CaMK2D的催化结构域，并不依赖经典的E1-E2酶催化途径。.结论：本结果首次表明FAT10在心肌肥厚的病理过程中发挥着抵抗肥厚地保护性作用，而这种作用是通过抑制CaMK2D-RyR2依赖的钙信号途径而产生。

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