基于P-TEFb激酶复合物与GATA-1信号交联对红系分化调控机制的汉黄芩素抗慢性粒细胞白血病的研究

The incidence of CML is highest in chronic leukemia. Tyrosine kinase inhibitors are applied clinically with high risk of resistant and relapse. Differentiation induction therapy has low toxic and side effect and has made remarkable achievements in the treatment of acute promyelocytic leukemia. However, differentiation strategy hasn’t been successfully applied in the treatment of CML with rarely investigation on it. The previous research by our research group found that wogonin could induce erythroid differentiation of CML cells and inhibit cell growth, which is related to the up-regulation of GATA-1 expression. It has been reported that wogonin shows CDK9 inhibitor activity. CDK9 constitutes the P-TEFb complex which plays key role in erythroid / megakaryocytic differentiation conversion point. This project aims to clarify regulation mechanism of cross-talk of P-TEFb complex and GATA-1 contributing to wogonin-induced erythroid differentiation. Also the project study the correlation between CDK9 activity of CML cells and erythroid differentiation, and response of CML stem/progenitor cells to wogonin, to evaluate the application prospect of erythroid differentiation strategy in the research and development of anti-CML drugs discovery, to provide a new idea of anti-leukemia research of natural products.

慢性粒细胞白血病（CML）在我国慢性白血病中发病率最高，目前临床应用酪氨酸激酶抑制剂治疗易耐药，复发风险高，而分化诱导疗法毒副作用低，已经在治疗急性早幼粒细胞白血病上取得瞩目成果。然而分化诱导疗法在治疗CML中的作用及机制研究未见报道。课题组前期研究发现，汉黄芩素能够通过上调GATA-1表达诱导CML细胞系发生红系分化并抑制细胞生长；近期文献报道汉黄芩素具有CDK9抑制活性，而CDK9参与构成的P-TEFb复合物在红系/巨核系定向分化调控中发挥关键作用。本项目旨在结合CML临床样本分析，探索CDK9活性与细胞红系分化潜能的关联性，阐明P-TEFb复合物和GATA-1的信号交联调控机制和汉黄芩素的诱导红系分化作用机理。同时本项目还根据CML原代细胞来源的CD34+CML干/定向祖细胞对汉黄芩素的应答来评价红系分化诱导策略在抗CML药物研发中的应用前景，为天然产物抗白血病研究提供新思路。

P-TEFb由CDK9和cyclin T1形成的激酶复合物，而P-TEFb被激活后磷酸化RNA聚合酶II从而促进RNA的转录和延伸。而在红系/巨核系定向分化转折点中，P-TEFb发挥着重要的作用，是细胞定向分化的关键调节子, 而抑制CDK9激酶活性可以调控红系分化的进程。已有报道汉黄芩素能够靶向抑制CDK9激酶，而在我们的先前研究中也发现汉黄芩素可以诱导CML细胞发生红系分化，本项目旨在深入探讨汉黄芩素抗CML的作用机制，研究它对P-TEFb激酶复合物的抑制作用以及P-TEFb与GATA-1的协同调控机制，为进一步阐明其抗CML 的确切机制提供新依据。本课题围绕P-TEFb激酶复合物展开研究，证明了CDK9这一复合物核心成分受到抑制以后能够定向诱导CML细胞红系分化。同时在细胞系和原代细胞中，作为CDK9激酶抑制剂的汉黄芩素均能够明显降低下游RNA PolⅡSer2及Ser5位点的磷酸化作用，从而抑制P-TEFb的活性，促进CML细胞红系分化。为了进一步探讨红系分化的具体机制，我们研究了P-TEFb与GATA-1的协同调控作用机制。GATA-1是启动细胞红系分化和巨核系分化的重要转录因子。而汉黄芩素能够促进GATA-1与FOG-1的结合，抑制GATA-1与RUNX1的结合从而促进细胞的红系分化，遏制巨核系分化，而这一过程高度依赖于P-TEFb。最后，本研究分别构建了KU-812细胞NOD/SCID小鼠移植瘤模型来研究汉黄芩素的体内抗CML作用。汉黄芩素显著抑制KU-812小鼠移植瘤的生长，降低了瘤重及瘤体积，其抑瘤效果与伊马替尼相当。同时，汉黄芩素能够缓解脾肿大并降低了接种小鼠脾脏中的人白血病细胞（huCD45+）浸润。而在KU-812细胞接种的NOD-SCID小鼠移植瘤模型组织细胞中，汉黄芩素显著下调RNA Pol Ⅱ的Ser2和Ser5位点的磷酸化，提示汉黄芩素体内对P-TEFb激酶活性的抑制作用。而对瘤组织细胞进行流式细胞术检测结果表明，与对照组相比，汉黄芩素显著增加瘤组织细胞表面抗原CD71、GPA的表达，提示汉黄芩素在体内促进了CML细胞红系分化。这些结果表明，汉黄芩素在体内外均具有着较好的抗CML作用，说明汉黄芩素具有成为抗CML新药的潜力，为天然产物治疗白血病研究提供新思路。

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