基于STAT3信号通路研究绞股蓝皂苷元H6逆转肝癌细胞对索拉非尼获得性耐药的机理

In the clinical treatment of hepatocellular carcinoma cells (HCC), as a first-line drug， sorafenib also exhibits serious side effects and acquired resistance without solutions. In previous in vitro and in vivo studies , the reversal effects of H6, a Gypenoside from Gynostemma Pentaphyllum, were found in HCC with acquired resistance to sorafenib. This project intends to study the effects of H6, when combined with sorafenib or not, on the change of cloning rate, cell cycle, apoptosis, invasion, metastasis and angiogenesis in resistance cells. All these changes account for the interaction and coadjustment between STAT3 pathway and the sorafenib targeted proteins. The mechanism of acquired resistance to sorafenib in HCC may result from the abnormal activation of STAT3 pathway. Meanwhile, the STAT3 pathway is also involved in the reversal effects of H6. Finally, the effect of H6 on "proliferation" and "angiogenesis" phenotypes was explored in an orthotopic xenograft nude mice models.

在肝癌（HCC）的临床治疗中，一线药物索拉非尼也产生了严重的副作用和获得性耐药，目前尚无解决办法。本课题前期研究发现，来自中草药绞股蓝的活性成分——绞股蓝皂苷元H6在体外和体内都可逆转HCC对索拉非尼的获得性耐药。为阐明H6可能的作用机理，本研究拟从体内和体外两个层面设计实验。体外实验主要观察H6和索拉非尼单用及联用情况下，是否对耐药细胞株的克隆形成率、细胞凋亡、细胞周期、侵袭、转移和血管生成等指标产生改变。推测以上改变是由STAT3通路与索拉非尼靶向的蛋白间相互调节所致。最终将证实STAT3通路的异常激活是肝癌细胞对索拉非尼产生获得性耐药的机理所在，而H6因为靶向STAT3通路使细胞重新恢复对索拉非尼的敏感性。最后，再从体内移植瘤动物模型观察H6和索拉非尼对上述 “增殖”和“血管生成”表型的影响，并对体外的可能机理进行验证。

本研究采用细胞生物学、分子生物学、流式细胞仪和裸鼠肝原位癌模型，首次发现：（1）SMMC-7721肝癌细胞株对索拉菲尼产生获得性耐药后，其细胞形态变化不大，生长速度较慢，细胞周期和细胞凋亡变化不明显。而其对索拉菲尼的耐药倍数可达4.65倍。（2）RNA水平发现，耐药基因P-gp、MRP和GST-π都有所增高，但是蛋白水平只有P-gp和MRP具有明显增高。其次， ERK1/2、VEGFR-2和PDGFR蛋白及其磷酸化水平在不同组别细胞中存在差异，发现所筛选7721/Sora耐药组细胞与对照组细胞相比，索拉菲尼作用靶点MAPK通路下游因子ERK1/2的磷酸化水平上调，VEGFR-2和PDGFR蛋白表达水平略有升高。p-STAT3表达增高。（3）证实H6在体外可逆转索拉菲尼耐药。7721/Sora 和 7721 细胞对 Sorafenib 的耐药倍数（RF）约为 4.65 倍，但是当加入不同浓度（ 5 μM， 10 μM， 20μM）的 H6 后，可以使 7721/Sora 细胞对 Sorafenib 的敏感性增加了 1.95-5.2倍。分子水平研究发现，H6在体外可以抑制多药耐药蛋白P-gp和MDR1的高表达；对于索拉菲尼靶向蛋白p-PDGFR和p-ERK的磷酸化水平均有一定程度抑制。（4）证实H6在体外逆转索拉菲尼耐药的机制可能与其对p-STAT3的抑制有关，并由此抑制其下游通路。我们发现H6的作用机制可能是通过抑制STAT3的磷酸化，然后抑制ERK1/2、VEGFR-2和PDGFR蛋白的磷酸化，最后抑制了P-gp、MRP蛋白的表达，从而发挥耐药逆转作用！同时，H6对于肝药酶P450中的CYP3A4并无抑制作用。（5）裸鼠原位癌研究证实H6在体内可以逆转索拉菲尼的耐药，其机制同样与p-STAT3的抑制有关。H6单独使用时，在50 mg/kg给药时可产生明显的抑瘤效果，与对照组相比，p<0.05。而当不同剂量的H6与相应剂量的索拉菲尼联用后，抑瘤率分别达到69.78%和75.86%，具有显著的协同作用，说明H6在体内的确使的7721/sora细胞株重新恢复了对索拉菲尼的敏感性！上述结果证明H6是一个有效、低毒、不影响药物代谢且机理清楚的新一代耐药逆转剂，具有较强的应用前景。

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