群体感应系统阻遏抗真菌剂藤黄绿菌素生物合成的分子机制

Pyoluteorin (Plt) is a broad-spectrum antifungal antibiotic produced by rhizosphere Pseudomonas. We have carried out extensive in-depth studies about Plt biosynthesis and its regulation in the Plt-producing Pseudomonas strain M18. Three Pseudomonas quorum sensing (QS) systems (Las,Rhl,PQS), which are respectively composed of signalling molecule synthase(s) (LasI, RhlI and PqsABCDE) and response regulator (LasR, RhlR and PqsR), were shown to strongly inhibit Plt biosynthesis and its gene expression in the strain M18. These three QS systems mainly activate the expression of relevant target genes, and their activation mechanism have also been clarified. However, the molecular mechanisms by which these QS systems directly exert their transcriptional repression on target genes remain unknown. In this study, we will comparatively study and thus clarify the molecular mechanisms involved in transcriptional repression of three QS systems on Plt biosynthesis and its gene expression through DNA mutation, lacZ report analysis, EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay), SPR (Surface Plasma Resonance), RT-PCR, et al., including: (1) identifying and characterizing target promoters and other DNA elements; (2) analyzing the interaction mechanisms between response regulators and their target DNAs; (3) evaluating the necessity and function of the signaling molecules in repressing regulatory action by QS; (4) dissecting QS cascade regulatory pathway involved in inhibition of Plt biosynthesis; (5) exploring the function of Px promoter that is repressed by PqsR. This study will lay the foundation for illustrating the regulatory mechanism and network of Plt biosynthesis and the molecular mechanism of QS repressing regulation in bacteria。

藤黄绿菌素(Plt)是根际假单胞菌合成的一种具有广谱抗真菌活性的抗生素。课题组针对假单胞菌株M18，前期已深入开展其Plt合成及调控的相关研究。其中发现三大假单胞菌群体感应(QS)系统(LasI/LasR、RhlI/RhlR、Pqs/PqsR)均强烈抑制Plt合成及基因表达。这些QS系统主要激活相关靶基因的表达，其转录激活机制也研究得较为透彻。然而，QS直接参与转录阻遏的分子机理尚不清楚。本项目拟运用DNA突变、lacZ报告分析、EMSA、SPR、RT-PCR等技术，比较研究三大QS系统阻遏Plt合成基因表达的分子机理,包括：鉴定靶启动子及结合元件；分析应答调控子与靶DNA的相互作用机制；评估信号分子在QS阻遏调控中的必要性与分子功能；剖析抑制Plt合成的QS级联调控通路；探索受PqsR阻遏的Px启动子的功能。为阐明Plt合成调控机制与网络奠定基础，为诠释细菌QS阻遏调控机理作出贡献。

藤黄绿菌素（Pyoluteorin, Plt）是根际假单胞菌产生的一种广谱PKS-NRPS杂合抗生素，能有效抑制植物病原真菌特别是瓜果腐霉、疫霉和水稻纹枯病菌。Plt生物合成基因簇由pltLABCDEFG结构操纵子及其转录激活子pltR组成。Plt合成分别受到三大群体感应（Quorum sensing，QS）系统的独立负调控，包括由高丝氨酸内酯介导的经典QS系统LasI/LasR与RhlI/RhlR、由喹啉分子介导的PQS/PqsR系统。本课题旨在研究QS对Plt合成的分子调控机制。经过四年研究，目前顺利完成预定的研究目标与内容。课题运用基因敲除与互补、lacZ报告基因分析、信号分子添加实验、蛋白-DNA相互作用的EMSA分析等手段，研究并阐明了假单胞菌株M18中Las、Rhl、PQS三大QS系统对Plt生物合成基因表达的分子调控机制：①LasI/LasR或RhlI/RhlR系统，分别独自激活plt操纵子表达及Plt合成。但两个系统之间存在相互拮抗作用，而相互降低对方独自激活plt操纵子表达的效率。因此，Las与Rhl单个系统突变，反而提高了Plt生物合成及基因表达，同时突变则完全抑制Plt合成。同时，相应信号分子在Las、Rhl各自激活Plt合成调控中均是必需的，PltR部分介导了Las或Rhl QS系统对Plt合成及基因表达的激活。②在PQS系统阻遏Plt合成调控中，PqsR与同属LysR家族的plt转录激活子PltR，竞争结合lys box位点，从而降低PltR的结合及激活效率，从而对plt表达及Plt合成产生负调控作用。然而，PQS、HQQ分子在PqsR负调控Plt合成中有促进作用，但不是必需的。.相关研究成果已在国际微生物权威刊物《Journal of Bacteriology》上发表研究论文1篇；在国内核心刊物上发表论文3篇。目前已有2篇研究论文分别提交至国际微生物权威刊物《Molecular microbiology》（处于修改阶段）、《Environmental Microbiology》（处于审稿阶段），争取近期发表；另外正在整理的1篇英文论文，也希望能发表在高水平期刊上。本项目共培养研究生5名。研究成果将为阐明Plt合成的调控网络奠定基础，也为其它微生物次生代谢的分子调控研究提供借鉴。同时为开展代谢工程提高Plt产量提供依据，以加快Plt应用。

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