枯草芽孢杆菌DC-12发酵生产豆豉纤溶酶（DFE）的定量蛋白质组学分析及DFE的天然底物鉴定

微生物纤溶酶具有溶解血栓的作用，在溶栓药物和保健食品方面有着广泛的应用前景。目前，对于微生物发酵生产纤溶酶的研究主要集中在发酵条件优化，而对发酵过程的分子机制的研究则未见报道，而且微生物纤溶酶在其产生菌体内的天然底物也不清楚。基于此，本课题拟以产豆豉纤溶酶(Douchi Fibrinolytic Enzyme, DFE）的枯草芽孢杆菌DC-12为对象，利用定量蛋白质组学技术，研究在不同发酵时间下DC-12的蛋白质表达差异，以期从蛋白质组学水平上探讨纤溶酶发酵合成的机理，为进一步通过分子育种提高DFE产量和活性奠定基础；同时，对DC-12及其DFE缺失菌株在发酵过程中的蛋白质差异进行比较分析，以鉴定DFE的天然底物，并对天然底物的基因进行克隆和表达，研究DFE对这些底物的催化特性，进一步阐明在菌体内DFE的生理功能和活性调控机制。

豆豉纤溶酶（DFE）是近些年从传统发酵食品中分离出来的具有预防和溶解血栓的新型溶栓酶，其酶学最适反应条件与人体内环境相似，且无毒副作用，是一种安全的高效溶栓剂，具有良好的开发利用前景。目前国内外的研究主要在筛选高产纤溶酶菌株、优化发酵条件以及利用基因工程手段克隆表达DFE基因并用基因工程菌表达来提高其产量，对于微生物体内相关代谢途径和蛋白质表达的分子机制的研究却很少。因此，本课题拟在前期的基础上对已保存产DFE菌株解淀粉芽孢杆菌DC-12进行差异蛋白质组学的方法研究其某些时间点的蛋白质差异，旨在探寻影响DFE合成的相关蛋白质，为今后菌株优化工作和工程改造的构建奠定了理论基础，同时也填补DFE产生菌比较蛋白质组研究的空白。主要研究内容为：（1）对DC-12进行全基因组测序，利用PCR相关技术获得测序缺口的序列碱基信息，从而获得其全基因组的相关基因的信息。（2）利用iTRAQ与LC-ESI-MS/MS结合的方法研究DC-12在发酵不同时期细胞外、细胞壁和细胞质的蛋白质组变化情况，并对这些差异蛋白质点进行鉴定，以期找到影响DFE合成的相关蛋白质。同时研究DC-12原始菌和DFE基因缺失菌株细胞外、细胞壁和细胞质的蛋白质差异，从而鉴定其是否存在天然底物。重要结果、关键数据及其科学意义：（1）基因组测序确定DC-12为解淀粉芽孢杆菌，其基因大小为4.02MB，基因数量为 4200个，基因组的GGC含量为46.08%；（2）发现解淀粉芽孢杆菌基因组中可能存在7种丝氨酸蛋白酶基因，其中可能含有3种纤溶酶，4种消化类丝氨酸蛋白酶。并且AprE的部分水解产物AprE51也被证实具有纤溶活性。并且AprE, AprE51, AprX 和IspA 的分子量大小推测分别为 39.14kDa，27.5kDa，48.17kDa 和33.85kDa。（3）最初产纤溶酶的时间点为6h，产酶最高的时间点为54h，最高酶活可达到1034IU/mL，而4h之前，发酵液中没有酶活；（4）iTRAQ分析，细胞质中鉴定的蛋白596个，其中347个差异蛋白列相关的134条KEGG信号/代谢通路；细胞壁和细胞膜中鉴定的蛋白833个，其中486个差异蛋白序列相管差异蛋白序相关的145条 KEGG信号/代谢通路所有注释通路；细胞外蛋白共有397个，其中238个差异蛋白序相关的107条KEGG信号/代谢通路。

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