利用PTD-转录因子融合蛋白重编程牛成纤维细胞

已有的研究表明，体细胞可以通过病毒介导的转录因子的异位表达而实现重编程，从而获得诱导的多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）。多项研究已证实利用转录因子诱导体细胞重编程的方法适用于多个物种的不同细胞类型，但是目前尚无成功建立牛iPS细胞系的报导。由于病毒介导的外源基因在靶细胞DNA上的随机整合，带来了研究者对病毒诱导的iPS细胞的安全性顾虑。为此，本项目拟以牛的成纤维细胞为材料，利用蛋白跨膜转导区域（protein transduction domains, PTD）-转录因子融合蛋白直接转导靶细胞以获得无外源基因整合的牛iPS细胞；将进一步丰富iPS细胞库和iPS细胞的临床应用提供技术支持。

已有研究表明，通过病毒介导转录因子异位表达可将体细胞重编程为诱导多潜能干细胞(Induced pluripotent stem cell, iPS)，但存在安全性问题。因此，为获得生物安全的牛iPS细胞，本项目围绕利用蛋白转导区域(protein transduction domain, PTD)-转录因子融合蛋白直接重编程牛成纤维细胞，进行了一系列研究和理论分析，获得如下结果：①获得了来源于成年牛的成纤维细胞和牛胚胎成纤维细胞，为iPS研究提供了起始细胞。②构建了含Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc（OSKM）的2套原核表达载体pProEx-HTa/TAT-O/S/K/M和pProEx-HTa/O/S/K/M-11R，实现了融合蛋白的表达和纯化；发现跨膜融合蛋白量呈浓度和时间依耐性，但只有极少量融合蛋白到达细胞核，蛋白活性低；而先进行融合蛋白复性和纯化，再处理细胞，所获得的活性蛋白的量也不足以诱导细胞重编程。③为规避pProEx-HTa原核表达蛋白难于跨膜与复性的缺点，构建了牛6个因子（OSMKNL）的双PTD原核表达载体pTAT-HA-bIF-9R和真核表达载体pcDNA3.1-bIF-9R-myc-His，并成功表达了6个原核蛋白，目前正进行原核融合蛋白的纯化与真核稳定表达融合蛋白细胞系的建立，为探索蛋白重编程提供了新思路。④考虑到蛋白表达纯化的复杂性，选择了SV40 T和Oct４、Sox2进行mRNA介导的体细胞重编程研究，发现转染诱导因子mRNA的细胞均正确表达目的蛋白，且外源转染的体外转录mRNA能特异性地激活细胞内源性干性标志基因Nanog的表达，开启了体细胞重编程过程，这为iPS研究提供了科学参考。目前该部分研究还在进行。⑤初步探索了牛体细胞重编程的机制：发现Oct4在胎牛和成年牛不同组织中具有不同甲基化谱；筛查并鉴定了垂体发育早期与Oct4共同表达的PROP1基因关键遗传变异位点（H173R）及其遗传效应；在DNMT3b甲基化模式研究中提出了评价甲基化水平的新指标；综述了iPS的诱导方法、诱导效率、诱导机理以及大家畜iPS研究现状。通过本项目的实施，摸索出了一套用于重编程的蛋白表达纯化和转染体外转录mRNA的方法，积累了重编程的科学资料，培养了学生，发表了研究论文，提升了项目主持人和骨干成员的科研创新能力。

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