cpg15在脑缺血后海马星形胶质细胞的谷氨酸转运和代谢中的作用及机制

Glutamate induced excitotoxicity is an important mechanism which leads to ischemic neuronal injury. Glutamate transporters and glutamine synthetase expressed by astrocytes are the key proteins that mediate the uptake and metabolism of glutamate respectively and reduce the excitotoxicity. However, the regulation mechanisms of their functions are unknown by far. The results of our previous studies suggest that neurotrophic factor cpg15 might reduce the excitotoxicity neuronal injury induced by cerebral ischemia via up-regulating the gene expression of these two types of proteins, which could increase the astrocytic uptake and metabolism of glutamate. In the present project, histochemistry, cytochemistry and molecular biological analyses will be comprehensively used to investigate the function and mechanism of cpg15 in the neuroprotective function of hippocampal astrocytes after cerebral ischemia, in the transient global cerebral ischemic model of mice, and the oxygen-glucose deprivation model (OGD) of cultured hippocampal astrocytes. The expression level of GLT-1 and GLAST (the two major glutamate transporters in astrocytes) and the glutamine sythetase, and the ability of glutamate-uptake of the astrocytes will be characterized to determine the differences induced by altering cpg15 protein concentration via gene silencing, immunoadsorption, or recombinant cpg15 protein. In addition, inhibition of several possible related signal molecules will be used to investigate the roles of these signal pathways in mediating cpg15-induced neuroprotection.

谷氨酸兴奋毒是脑缺血引起神经损伤的一大主要机制。星形胶质细胞（AS细胞）表达的谷氨酸转运体及谷氨酰胺合成酶，是介导谷氨酸摄取和代谢，从而降低兴奋毒的关键蛋白，但其功能调控机制尚不清楚。我们的前期研究提示，神经营养因子cpg15可能通过上调这两类蛋白的基因表达，来促进脑缺血后AS细胞对谷氨酸的摄取和代谢，从而促进其神经保护功能。本项目将在我们前期研究的基础上，采用组织化学、细胞化学、及分子生物学手段，在小鼠脑缺血模型和海马AS细胞氧-糖剥夺模型上，利用基因表达沉默、蛋白免疫吸附、或重组蛋白等方法干预cpg15，或用特异抑制剂干预cpg15下游可能的信号通路分子, 通过比较cpg15 或其下游分子干预前后，AS细胞的两种主要谷氨酸转运体（GLT-1和GLAST）及谷氨酰胺合成酶的表达、以及AS细胞摄取谷氨酸能力等的差异，来探讨cpg15在脑缺血后海马AS细胞的神经保护作用中的功能和机制。

在脑缺血引起的谷氨酸兴奋毒性神经元损伤中，存在于星形胶质细胞上谷氨酸转运体和神经元细胞上的谷氨酸受体，是两大关键的影响因素，但其功能调控机制尚不清楚。在本项目中，我们主要聚焦于神经营养因子Cpg15在脑缺血所致的神经元兴奋毒性及氧化应激损伤中的作用及其机制。采用组织和细胞化学及分子生物学手段，在小鼠全脑缺血-再灌注模型，以及海马星形胶质细胞及神经元等细胞氧-糖剥夺、兴奋毒性、氧化应激模型上进行研究，获得了以下主要结果：首先，我们发现，脑缺血后，海马星形胶质细胞中Cpg15表达显著上调，并可分泌、结合于损伤的海马神经元，抑制神经元损伤，促进损伤神经元修复。其次，脑缺血后，小鼠海马星形胶质细胞中谷氨酸转运体 GLT-1和GLAST与Cpg15表达均上调，敲低星形胶质细胞中的Cpg15表达，可逆转高浓度谷氨酸处理引起的细胞中GLT-1和GLAST的表达增加。提示星形胶质细胞中的Cpg15表达的上调，可能通过增加GLT-1和GLAST的表达，促进其谷氨酸摄取功能，从而降低缺血引起的脑损伤。此外，我们发现，Cpg15在神经细胞氧化应激中的具有保护作用，该作用可能通过调控其氧化还原相关酶SOD和COX2表达或活性、或激活Nrf2/HO-1抗氧化通路来实现。我们还发现，谷氨酸毒性引起神经节细胞Cpg15表达显著降低、神经节细胞的损伤和丢失，以及R28细胞的损伤和死亡，特异性铁死亡抑制剂可以阻断谷氨酸毒性引起的细胞死亡，提示该死亡模式主要是铁死亡。NMDA和AMPA谷氨酸受体在谷氨酸毒性引起R28损伤和死亡中共同发挥作用。此外，鉴于神经元氧化应激在睡眠剥夺引起脑损伤中的重要作用，我们还适当拓展了Cpg15在睡眠剥夺引起的脑内神经元氧化应激损伤中的作用和可能的机制的探究。研究结果为利用神经营养因子作为治疗靶点用于脑缺血等疾病的治疗提供理论基础。

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