中介体中部模块核心复合物Med7-21-4-9的结构生物学研究

The Mediator complex plays a vital role in eukaryotic transcription by “mediating”and passing the regulatory signals from transcription factors to the RNA polymerase II, resulting in either transcription activation or suppression. Malfunctioning of the Mediator complex has been implicated in cancer, cardiovascular diseases, metabolic and neurological disorders. However, due to its low native abundance, complex subunit composition and conformation, it is highly challenging to extract native Mediator complex of sufficient quality and quantity for obtaining high-resolution structures via conventional approaches, hindering further elucidation of its molecular mechanisms..To address those bottlenecks, we aim to co-express Mediator subunits from Chaetomium thermophilum (a thermophilic fungus), in order to produce a stable and homogeneous core complex of the Mediator Middle Module (Med7-21-4-9), which will be subjected to structural analyses using the hybrid approach combining X-ray crystallography and 3D EM reconstruction. Outcomes of this project will serve as a prerequisite for elucidating the structure and subunit architecture of the complete Mediator Middle Module.

中介体复合物(Mediator complex)在真核转录调控中起着关键的“中介”作用：将来自于转录因子的调控信号传递给RNA聚合酶Ⅱ，从而激活或抑制相应基因的转录。中介体复合物功能的异常会诱发癌症、心血管疾病、代谢和神经障碍。然而，由于中介体复合物在细胞中的内源含量很低，难以通过直接提取来得到足量优质的样品；此外，其亚基组分和结构十分复杂，导致难以用传统手段获得高分辨率结构信息，这极大地阻碍了对其分子机理的进一步认识。.为攻克上述难点，我们计划使用新型昆虫细胞表达系统(MultiBac)，通过共表达来自于嗜热毛壳菌的中介体复合物亚基，来制备稳定的，结构均一的中介体中部模块核心复合物(Med7-21-4-9)样品，并结合运用X射线晶体学以及电镜三维重构等结构生物学手段，解析该核心复合物的结构并构建亚基分布图谱。该工作将显著推进我们对于完整中介体中部模块结构以及亚基组织架构的了解。

中介体复合物（Mediator Complex）是一种高度保守的多蛋白分子机器，在真核细胞转录调控中扮演着重要角色，它负责将来自于转录因子（transcription factors）的调控信号传递到RNA聚合酶Ⅱ基础转录机器（RNA polymerase II general transcriptional machinery），从而激活或抑制相应基因的转录。此外，有研究表明该复合物与一系列发育性疾病和癌症的产生直接相关。中介体复合物包含25-30个亚基，分子量为1.0-1.2 MDa，通常被划分为四个结构模块：头部模块、中部模块、尾部模块以及具有激酶活性的CDK8模块。由于该复合物在细胞中的内源含量很低、亚基组成和构象较为复杂，难以通过直接提取来得到足量优质的样品，导难以使用传统分子生物学和结构生物学手段来获得高分辨率结构信息，阻碍了对其分子机制的进一步阐明。.为解决这一挑战，本项目拟采用“化整为零”的策略，聚焦于获取稳定的、结构均一的中部模块核心复合物——Med4-9-7-21四元复合物，解析其高分辨率结构并构建亚基分布图谱，为进一步解析完整中部模块的结构及亚基组织架构奠定基础。.在项目执行期间，我们成功使用新型昆虫细胞表达系统——MultiBac系统获得了嗜热毛壳菌（一种嗜热真菌）的Med4-9-7-21四元复合物，此外还成功获得了一系列中部模块的亚复合物，以及完整的中部模块。我们随后用负染电镜技术对Med4-9-7-21、Med1-4-9、Med1-4-9-7-21和Med1-4-9-7-21-10-31复合物进行了观察和数据收集，并对其进行了二维分析、三维重构和三维分类。.通过比较这些复合物的初始三维模型，我们可以明确地定位Med4-9-7-21以及完整中部模块的各个亚基。此外，我们还在二维分类结果中清楚地观察到了Knob区域（对应于Med7和Med31的N端结构域）的灵活性。由于头部模块的Neck区域和中部模块的Knob区域共同在稳定RNA聚合酶II的C-末端结构域（CTD）和促进真核转录起始方面起着至关重要的作用，我们观察到的Knob区域的灵活性可能具有重要的生物学意义。

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