活性糖苷类化合物及其衍生物的生物合成研究

Glycosides (e.g. gastrodine, salidroside), many of which are natural products from medicinal herb, have a wide range of applications in medical fields, especially for the effective treatment of neuropathic, immune, cardiovascular, and Alzheimer's diseases. However, traditional approaches of plant extraction and chemical synthesis show low efficiency and cannot meet the fast growing demands on bioactive glycosides. Biosynthesis strategy and enzymatic structural derivatization of glycosides have demonstrated great potential for resource supplies and improvement of pharmacological activities. Thus, the related researches have not only great theoretical significance, but also application values in generation of glycosides with novel biological activity. Through microbial enzyme engineering and metabolic engineering, this project is aimed to developing a new approach for efficient biosynthesis of glycosides and their derivatives from alkylphenols by coupling a cytochrome P450 monooxygenase based alkylphenol bio-oxidation system with the activity of UDP-glycosyltransferase (UGT). Moreover, enzymatic properties and catalytic mechanisms of the key involved enzymes including P450s and UGTs will be elucidated. This study will not only result in an innovative biosynthetic strategy for production of glycosides, but also generate a number of novel “unnatural” bioactive glycosides, thus providing new thinking and materials for designing and developing new glycoside drugs.

许多糖苷类化合物是药用植物来源的活性天然产物，在医药领域应用广泛，尤其对神经、免疫、心血管和老年痴呆性疾病疗效显著。传统种植提取或化学合成该类化合物的效率低下，远不能满足人们对药用糖苷类化合物的需求。生物合成策略及酶法结构衍生改造在糖苷类化合物的资源供给和药效改进方面潜力巨大，其研究不仅具有重要的基础科学意义，而且对新活性糖苷类药物的创制也具有重要的实践指导意义。本项目拟利用微生物酶工程和代谢工程手段将申请人前期构建的以细胞色素P450单加氧酶为主导的烷基酚生物氧化系统与UDP-葡萄糖苷转移酶（UGT）的催化活性相偶联，实现从烷基酚到糖苷类化合物及其衍生物的高效生物合成，并解析生物合成过程中关键P450酶和UGT的酶学特性与催化机理。本项目的实施不仅将开发出糖苷类化合物的创新性生物合成方法，而且有望获得新结构“非天然”活性糖苷类分子，为设计及开发新型糖苷类药物提供新的思路。

糖苷类化合物具有非常重要的临床药用价值。然而，通过植物提取、化学合成和传统的生物转化生产糖苷类化合物远远不能满足现今社会快速增长的需求。在本研究中，我们体外表征了两种植物来源的高效UDP-葡萄糖基转移酶(UGT)：UGT85A1和RrUGT3。基于这两种UGT酶，我们建立了微生物细胞工厂用于催化多种酚类化合物来生物合成多种糖苷类化合物。我们通过将前期开发的烷基酚生物氧化系统和UGT相藕联，可以直接以烷基酚底物生物合成生物活性糖苷类化合物及其衍生物。我们筛选获得的两种UGT显示出互补的区域选择性：UGT85A1和RrUGT3分别特异性识别酚类化合物的醇羟基和酚羟基。进一步，基于AlphaFold的结构建模、分子对接和定点突变实验，我们揭示了糖基受体结合口袋的结构以及底物和特定残基之间的相互作用是造成RrUGT3和UGT85A1不同的区域选择性的关键。值得注意的是，这两种UGTs制备的非天然糖苷类化合物中，部分化合物表现出比临床使用的糖苷类药物（天麻素、红景天苷和豆腐果苷）更好的脯氨酰内肽酶抑制和抗炎活性。此外，这两种UGT还能够催化N-和S-糖苷键的形成，产生N-和S-糖苷化合物，对于开发新型糖苷药物具有巨大潜力。

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