胞内触发释药式肿瘤主动靶向纳米载体的构建及功能研究

鉴于天然生物大分子透明质酸（HA）易被多种肿瘤细胞特异性摄取的特性，及肿瘤细胞内部独特的强还原环境，本项目首次选择HA为分子骨架，通过还原敏感型连接臂引入疏水基团，以自组装技术构建具有胞内触发定位释药功能的主动靶向纳米载体体系（redox-HA），该体系具有高效载药、稳定转运、肿瘤靶向及靶细胞内触发释药等优点。本项目将设计合成多种redox-HA，系统考察HA分子量、疏水基团种类（烷基、胆酸类）及修饰量、化学连接臂对其自组装、载药能力及触发还原敏感性的影响；并结合redox-HA纳米系统在细胞内的微动力学及其体内肿瘤转运特征和抗肿瘤活性，探讨其细胞靶向摄取及胞内触发释药机制，为建立安全、高效抗肿瘤药物传输系统提供实验基础和理论依据。本项目首次将还原敏感技术、肿瘤靶向性生物大分子和自组装技术有机结合，构建了胞内触发释药式肿瘤主动靶向纳米载体，为抗肿瘤靶向给药系统的设计提供了一种新思路和方法。

聚合物胶束是难溶性抗肿瘤药物递送载体研究热点，然而由于药物释放过于缓慢而影响了药物疗效的发挥。本项目针对肿瘤细胞胞浆由于代谢异常而产生独特的高还原生理环境（肿瘤细胞内谷胱甘肽GSH浓度高达20 mM，细胞外环境仅10μM），以对肿瘤细胞具有高度亲和性的天然生物大分子透明质酸（hyaluronic acid，HA）为亲水链段，通过还原敏感性连接臂引入疏水基团脱氧胆酸，成功构建两亲性的还原敏感型HA衍生物（HA-ss-DOCA）。该衍生物在水溶液具有较低的临界胶束浓度（34.7mg/L），对难溶性模型抗肿瘤药物紫杉醇(PTX)具有优越的增溶效果，最高载药量高达34.1 %，包封率高达93.2%。本项目以非还原HA-DOCA胶束为对照，考察了还原敏感胶束体外还原敏感性，动态光散射和原子力显微镜（AFM）结果表明，空白还原敏感胶束对20 mM GSH产生快速响应，结构迅速解聚，而在10 μM GSH中保持完整结构。体外释药动力学结果表明，载药还原敏感胶束呈现出GSH触发的还原敏感型释放，而非还原敏感胶束释放行为不受GSH影响。本项目以乳腺癌细胞（MDA-MB-231）和人胚肺成纤维细胞（HELF）为模型细胞考察了载香豆素6和尼罗红的还原敏感胶束的细胞摄取行为。结果表明，MDA-MB-231细胞对胶束的吞噬呈现时间、浓度及温度依赖性，具有主动转运的特征，且还原敏感胶束最易被吞噬，其吞噬系通过HA受体介导。而HELF细胞由于无HA受体表达对胶束摄取较低。激光共聚焦经时照片显示，还原敏感胶束可快速、高效的将包裹于内核的尼罗红探针释放至细胞质中，而非还原敏感胶束细胞内尼罗红释放速度缓慢。MTT细胞毒和凋亡实验结果表明，与市售Taxol®及非还原胶束相比，载药还原胶束能更迅速和高效的发挥对MDA-MB-231的细胞毒性，而对HELF细胞毒性小，表明还原敏感载体可提高PTX的肿瘤靶向性和选择性。本项目进一步考察了载Cy7胶束在MDA-MB-231荷瘤裸鼠体内的组织分布特征，结果表明，还原敏感胶束具有更强的肿瘤靶向性。药效学结果表明，Taxol®及胶束制剂均能显著抑制肿瘤生长，其中载药还原胶束表现出最佳的抑瘤效果及最低的毒副作用。溶血、急毒实验、血管刺激性实验表明含药胶束制剂比市售制剂具有更高安全性。本项目研究结果表明，所构建的还原敏感胶束在抗肿瘤药物递送领域具有优越的应用前景。

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