分裂泛素化酵母双杂交系统探究高龄SHR心脏组织中KCNE2蛋白发生磷酸化修饰的机理

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项目介绍
AI项目解读

基本信息

  • 批准号：
    30971220
  • 项目类别：
    面上项目
  • 资助金额：
    31.0万
  • 负责人：
    王慧莲
  • 依托单位：
    西安交通大学
  • 学科分类：
    H0213.血压调节异常与高血压病
  • 结题年份：
    2012
  • 批准年份：
    2009
  • 项目状态：
    已结题
  • 起止时间：
    2010-01-01 至2012-12-31

项目摘要

KCNE2是几种钾通道β亚基，也是心脏钾通道功能一个重要的调控亚基。我们前期研究发现：高龄SHR大鼠心室肌中KCNE2第98位氨基酸发生了磷酸化修饰；且磷酸化的KCNE2导致心脏电生理功能异常。本项目将通过下列几方面研究（1）利用免疫共沉淀技术，查找高龄SHR大鼠心室肌中使KCNE2蛋白发生磷酸化修饰的激酶（2）应用消减抑制杂交法,构建高龄/幼龄SHR大鼠心室肌细胞差减cDNA文库；利用新型分裂泛素化酵母双杂交筛选参与KCNE2蛋白磷酸化过程的辅助性蛋白质（3）利用RNA干扰技术抑制辅助性蛋白质在SHR动物模型中的表达，进一步探究该蛋白的不表达对SHR大鼠异常的心脏功能是否有调好作用。从而一方面从分子水平上对高龄SHR大鼠心室肌中KCNE2蛋白发生磷酸化修饰的机理作进一步的探究；另一方面为室性心律不齐疾病的临床诊断和基因治疗提供科学依据和药理学上的靶位点。

结项摘要

为了求证我们的假设：在高龄SHR大鼠心室肌细胞中，心脏处于高血压和心肌细胞衰老这种生理状况，诱导出了某些蛋白质的表达，而其中有一个或多个蛋白质参与了KCNE2蛋白质磷酸化异常的过程，从而导致大鼠心脏正常生理功能的损伤。.为此本项目我们主要通过（1）分离培养幼龄和高龄SHR和WKY(对照)心肌细胞，并分别提取它们的 mRNA，以RT-PCR方法扩增各细胞的cDNA;再利用消减抑制方法成功地构建了幼龄/高龄SHR大鼠差减cDNA文库：即通过蓝白斑筛选，获取高龄/幼龄SHR大鼠心肌组织正向消减文库的阳性克隆，随机选择部分阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定，发现插入片段的大小主要集中在200-1000bp之间；且长度并不均一,说明我们所构建的文库具有一定复杂性。将上述阳性质粒随机送出测序，将测序结果与GenBank数据库中cDNA和EST序列进行相似性比对，获得差异性表达的cDNA文库。（2）通过一系列含KCNE2诱饵载体构建、分裂泛素化的酵母双杂交实验、 阳性克隆的转化、序列测定和BLAST 比对，发现两种不同的蛋白编码序列，它们分别编码K1和K2蛋白,其中K1是SHR大鼠心肌的一个功能已知的膜结合蛋白；K2为未知功能的蛋白序列。为了进一步探究K1和K2蛋白质在KCNE2磷酸化异常中的直接的功能，我们采用两种方法对它们功能做进一步研究：（1）用RT-PCR方法，扩增编码这两种蛋白的基因全长序列，构建过表达载体，通过相关细胞系和动物模型，研究其功能。目前这些实验正在进行之中。（2）用RNA干扰技术，沉默这两种基因的表达，目前这个研究工作已经取得阶段性的实验结果：分别构建了入门载体pENTR 1A－k1-siRNA, pENTR 1A－k2-siRNA和两种腺病毒表达载体：pAd /CMV /V5－DEST－k1-siRNA 及pAd /CMV /V5－DEST－k1-siRNA，并通过293A细胞将含目的基因的病毒包装成功, 并已经完成了第一代病毒滴度测定工作。目前正在进行病毒的扩增，滴度的测定和纯化工作，后续打算用相关的细胞系和动物模型研究其相关的功能。.对本项目获得实验数据的处理：(1)一部分的数据正在整理和分析，准备通过发文章和申报专利的方式展示功果；（2）另一部分实验数据，需要做进一步实验探究其功能，揭示其在 KCNE2磷酸化异常过程中真正的作用。这部分的工作具有非常

项目成果

期刊论文数量（2）
专著数量（0）
科研奖励数量（0）
会议论文数量（0）
专利数量（0）
含人谷胱苷肽过氧化物酶基因重组腺病毒的构建
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    --
  • 期刊：
    西安交通大学学报(医学版)
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    宁启兰;许楠;王慧莲;NING Qi-lan;XU Nan;WANG Hui-lian(Department of Gen
  • 通讯作者：
    WANG Hui-lian(Department of Gen
人过氧化氢酶基因重组腺病毒的构建及其酶活性的测定
  • DOI：
    --
  • 发表时间：
    --
  • 期刊：
    浙江大学学报(医学版)
  • 影响因子：
    --
  • 作者：
    欧阳晓玲;李爱玲;宁启兰;杨旭东;许楠;王慧莲;OU-YANG Xiao-ling1;3;LI Ai-ling1;2;NING Qi-lan1;YA;2.Department of Biological Science;Technology;3.Chenzhou No.1 People′s Hospital;Chenzhou 423000
  • 通讯作者：
    Chenzhou 423000

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  • 通讯作者：
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课题项目：调控A型流感病毒诱导IFN-β表达的机制研究

AI项目摘要：

本研究聚焦于TRIM2蛋白在A型流感病毒诱导的IFN-β表达中的调控机制。A型流感病毒是全球性健康问题，其感染可导致严重的呼吸道疾病。IFN-β作为关键的抗病毒因子，其表达水平对抗病毒防御至关重要。然而，TRIM2如何调控IFN-β的表达尚未明确。本研究假设TRIM2通过与病毒RNA或宿主因子相互作用，影响IFN-β的产生。我们将采用分子生物学、细胞生物学和免疫学方法，探索TRIM2与A型流感病毒诱导IFN-β表达的关系。预期结果将揭示TRIM2在抗病毒免疫反应中的作用，为开发新的抗病毒策略提供理论基础。该研究对理解宿主抗病毒机制具有重要科学意义，并可能对临床治疗流感病毒感染提供新的视角。

AI项目思路：

科学问题：TRIM2如何调控A型流感病毒诱导的IFN-β表达？
前期研究：已有研究表明TRIM2参与抗病毒反应，但其具体机制尚不明确。
研究创新点：本研究将深入探讨TRIM2在IFN-β表达中的直接作用机制。
技术路线：包括病毒学、分子生物学、细胞培养和免疫检测技术。
关键技术：TRIM2与病毒RNA的相互作用分析，IFN-β启动子活性检测。
实验模型：使用A型流感病毒感染的细胞模型进行研究。

AI技术路线图

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          A[研究起始] --> B[文献回顾与假设提出]
          B --> C[实验设计与方法学准备]
          C --> D[A型流感病毒感染模型建立]
          D --> E[TRIM2与病毒RNA相互作用分析]
          E --> F[TRIM2对IFN-β启动子活性的影响]
          F --> G[IFN-β表达水平测定]
          G --> H[TRIM2功能丧失与获得研究]
          H --> I[数据收集与分析]
          I --> J[结果解释与科学验证]
          J --> K[研究结论与未来方向]
          K --> L[研究结束]
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