普萘洛尔联合维罗非尼通过抑制MT1F克服维罗非尼获得性耐药的机制研究

Melanoma is one of the most deadly malignant neoplasms which is not sensitive to chemotherapy, radiotherarpy and the 5-year survival could be as low as 5%-13%. The newly developed BRAF inhibitor, vemurafenib, significantly improved patient survival. However, more than half of the responders developed aquired drug resistance (ADR) after 6 months treatment. In our previous study, we found that propranolol could overcome vemurafenib induced ADR incombination with vemurafenib in vitro and in vivo. However, no classifcal mechanism for vemurafenib ADR could be responsible for this effect. By highthroughput mRNA sequencing, we found that metallothioneins isoform 1F (MT1F) may play a key role in this process, although the mechanism is still unclear. Based on previous data, we hypothesize that propranolol plus vemurafenib may overcome vemurafenib induced ADR by inhibiting MT1F and its downstream signal pathway. In this study we propose to explore the mechanism for overcoming vemurafenib induced ADR in vitro and in vivo and provides new strategy to solve this problem in clinic.

黑色素瘤是一类对放化疗不敏感，预后极差的恶性肿瘤，5年生存率可低至5%-13%。近年来BRAF靶向抑制剂（维罗菲尼）显著提高了晚期黑色素瘤的总体生存率，为广大患者带来希望。然而，过半数患者在治疗6个月后出现获得性耐药并导致肿瘤复发。如何解决耐药问题成为全球公认的一大挑战。我们的前期研究发现，普萘洛尔联合维罗菲尼可有效克服维罗菲尼的耐药，动物实验也证实了这一发现。然而，维罗菲尼经典耐药机制却不能明确解释这一现象。随后，通过转录组测序我们发现金属硫蛋白1F(MT1F)可能在克服耐药的过程中起关键作用，但机制不明。据此我们提出猜测，联合用药可能通过抑制MT1F，调控其下游信号通路，抑制细胞增殖诱导凋亡，最终克服维罗菲尼耐药。本项目拟从细胞和动物水平探索联合用药克服维罗菲尼耐药的分子机制，并揭示相关分子靶点，为阐明其克服耐药的机制提供依据，并为临床解决BRAF抑制剂耐药问题提供新策。

黑素瘤是皮肤肿瘤中致死率最高的恶性肿瘤，占皮肤肿瘤致死率80%以上。维罗非尼是BRAFV600E突变的特异性抑制剂。临床研究显示，与传统化疗药物达卡巴嗪相比，维罗非尼显著提高了患者的无进展生存时间和总体生存时间。然而，大多数患者在治疗6-9月后出现疾病进展和获得性耐药。尽管关于维罗菲尼获得性耐药的机制报道众多，目前仍尚无有效药物克服或逆转其耐药。积极探索克服耐药的药物及其逆转机制具有重要临床价值。普萘洛尔属于β受体阻断剂，临床前和临床研究证实普萘洛尔具有显著的抗癌作用。然而，普萘洛尔对黑素瘤的作用具体机制仍未阐明，同时，普萘洛尔是否可以通过其抗肿瘤机制影响维罗菲尼耐药也是本研究的重点。 结果显示，1.25μM-400μM普萘洛尔处理细胞A375, 和原代黑素瘤细胞24h, 48h, 72h后，细胞活力呈浓度和时间依赖性地下降，并显著诱导细胞凋亡，阻滞细胞周期，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，促进凋亡蛋白Bax，细胞色素c，caspase-9和caspase-3的表达。同时，普萘洛尔还抑制B-RAF,p-B-RAF MEK1/2, p-MEK1/2,ERK1/2和p-ERK1/2的表达。体内研究显示低剂量普萘洛尔（2mg/kg/day）亦可显著抑制瘤体增长。IHC数据显示普萘洛尔显著抑制Ki67表达，促进肿瘤细胞坏死和凋亡，同时还显著抑制了p-BRAF，p-MEK1/2，p-ERK1/2和p-AKT的表达，抑制肿瘤细胞增值。在A375耐药细胞株和原代黑素瘤细胞耐药细胞株中，使用普萘洛尔2μM-200μM处理24h-120h后，普萘洛尔呈浓度和时间依赖地降低耐药细胞活力。20μM普萘洛尔合用0.5μM维罗菲尼显著地抑制耐药细胞的增殖并诱导凋亡。2mg/kg/day普萘洛尔联合10mg/kg/day维罗非尼治疗维罗非尼耐药动物模型21天后，显著缩小肿瘤体积。Kaplan–Meier结果显示普萘洛尔合用维罗非尼组生存时间显著延长，并伴随体重增加，Ki67染色阳性位点减少，TUNEL染色阳性反应增强，提示普萘洛合用维罗非尼尔抑制了肿瘤组织的增殖并诱导凋亡。RNA测序的数据显示普萘洛尔联合维罗非尼显著降低了MT1F的mRNA水平，过表达MT1F削减了联合用药对细胞活力和凋亡的影响。普萘洛尔联合维罗非尼逆转维罗非耐药的机制可能是通过抑制MT1F信号通路介导的。

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