核输出信号NESAR对前列腺癌雄激素受体活性调控的机制研究

Androgen receptor (AR) plays a key role in prostate development and carcinogenesis. In both androgen dependent and castration resistant prostate cancers (CRPC), AR is transcriptionally active. Besides, most of CRPC tumors are still dependent on androgen receptor signaling pathway. Hence, understanding the mechanisms regulating AR protein synthesis and/or degradation is clinically relevant and may lead to new approaches to prevent and/or treat prostate cancer. In the previous studies, we identified a novel putative Nuclear Export Signal in the ligand binding domain of AR, termed NESAR, which plays an important role in androgen-regulation of AR nuclear/cytoplasmic shuttling. NESAR containing fusion proteins exhibit markedly decreased stability and NESAR can signal for polyubiquitination. This project intends to further investigate: ①The stability, specificity and half-life of NESAR, and the mechanisms of NESAR regulation on androgen receptor activity of prostate cancer; ② Figure out NESAR key amino acid sequences that mediate its ubiquitination; ③ Explore the relationship between NESAR mediated nuclear export and its degradation. Our research will provide new insights into the modulation of AR protein level and activity, and thus help to understand the molecular mechanism of the degradation of AR and closely targeted regulation of AR during the progression of prostate cancer to castration-resistance.

雄激素受体AR在前列腺的发育和前列腺癌的发生发展过程中具有重要的作用。在雄激素依赖性和去势抵抗性前列腺癌CRPC中，AR均具有转录活性；且大多数CRPC肿瘤仍依赖于雄激素受体信号通路。了解调控AR蛋白表达和稳定性的具体机制将为临床预防和/或治疗前列腺癌提供新的方法。前期研究中发现，位于AR配体结合域中的核输出信号NESAR在AR的细胞浆/细胞核穿梭中具有重要作用；且NESAR的蛋白表达具有不稳定性，是多聚泛素化修饰的识别信号。本课题拟进一步研究确定：①NESAR的降解不稳定性、特异性及其降解半衰期，及其对前列腺癌雄激素受体稳定性调控的机制；②明确NESAR结构中介导其泛素化的关键氨基酸序列；③探索NESAR介导的出核与其作为降解基团之间的联系。课题研究将为AR蛋白水平和/或活性的调控提供一种新的研究思路，从而有助于对AR降解分子机制的了解和在前列腺癌产生去势抗性过程中对AR靶向的密切调控。

雄激素和雄激素受体AR在前列腺的生长发育、功能维持、以及前列腺癌的发生发展过程中均发挥着重要的作用。AR蛋白表达的升高和/或稳定性的增加，均可以增加前列腺癌细胞对低水平雄激素的敏感性，进而发展为具有去势抵抗性的前列腺癌。了解调控AR蛋白表达和稳定性的具体机制将为预防和/或治疗前列腺癌提供重要的临床参考和应用价值。.本课题应用免疫荧光和荧光显微镜、放射性同位素示踪、免疫共沉淀及蛋白印迹等方法，（1）证实了位于AR配体结合域LBD中具有出核转运信号肽的核转出蛋白NESAR（Nuclear Export Signal of Androgen Receptor）可以显著增强其融合蛋白在前列腺癌细胞中的降解；融合蛋白GFP-NESAR的降解半衰期小于3小时，约为对照GFP的十分之一；（2）NESAR作为多聚泛素化修饰的识别信号，介导了其融合蛋白在前列腺癌细胞中通过泛素-蛋白酶体途径的降解；（3）赖氨酸位点K776和K807突变的NESAR的泛素化水平显著降低，蛋白稳定性提高，是介导NESAR发生泛素化的关键氨基酸残基；（4）在配体雄激素DHT存在情况下，AR或LBD被诱导核定位，NESAR的活性被抑制，GFP-AR或GFP-LBD的泛素化被抑制，提示NESAR的出核为其介导多聚泛素化过程所必需；（5）蛋白酶体抑制剂MG132同时还诱导了转染含NESAR融合蛋白的PC3细胞核周围聚集体的形成，揭示NESAR在蛋白酶体介导的降解被抑制的情况下，能够诱导未折叠蛋白反应。.因此，NESAR在前列腺癌细胞AR的泛素化和蛋白酶体依赖的降解过程中发挥了重要的作用；同时揭示了LBD除了具有转录激活、进核、出核和受雄激素调控外，其结构域中还包含了受雄激素调控的降解基团NESAR，为AR蛋白水平和/或活性的调控开辟一种新的研究思路，有助于我们对AR降解分子机制的了解和在前列腺癌产生去势抗性的过程中对AR靶向的密切调控。此外，由于在其它类固醇受体中也存在结构相似的NESs，且在功能上高度保守，我们对NESAR功能机制的深入研究将对其它类固醇受体的研究具有重要的参考价值。

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