克隆分析法在体研究核团结构中神经干细胞的属性和自我更新的分子机制

The development of nervous system is precisely controlled by complex genetic network. Understanding the complex process of neural development is critical to dissect the pathogenesis of neonatal brain malformation. The mammalian brain consists of both laminar (e.g. neocortex) and nuclear (e.g. thalamus) structures. The thalamic malformation leads to attention deficit, schizophrenia and autism. However, little is known about the embryonic neural stem cells (eNSCs) in the nuclear structures. To gain insight into how neural cells arising from eNSCs are organized into individual nuclei, we will use single-cell lineage tracing (or clonal analysis) to label individual neuroepithelial cells in the thalamus, monitor the self-renewal capacity of thalamic eNSCs and investigate the spatial organization of structural units derived from single eNSCs. To study the role of Axin2 in regulating the self-renewal of eNSCs, we will further establish the “driver-driving single-cell genetic deletion” technology. Axin2 inhibits the activation of canonical Wnt-β-Catenin signaling pathway by a negative feedback loop and thus may decrease cell proliferation. Unexpectedly, our preliminary data show that single-cell genetic deletion of Axin2 compromises the expansion of eNSCs. Based on these unexpected results, we will take a deeper look at the novel molecular mechanisms underlying the self-renewal of eNSCs by RNAseq. The results of this proposal will help us clarify the formation of nuclear structures and the development of thalamus, as well as advance the research in immortalization of neural stem cells.

神经系统发育是由复杂基因网络精确控制的，理解其复杂发育过程可帮助解析新生儿脑发育缺陷的发病机制。大脑结构包括层状结构（如大脑皮层等）和核团结构（如丘脑等），丘脑发育异常可导致注意力缺陷、精神分裂症和自闭症等。我们对核团结构中的胚胎神经干细胞所知甚少,为了深入探索这些神经干细胞如何产生子代细胞并组织成神经核团，我们以丘脑为模型利用克隆分析法标记单个神经上皮细胞，研究核团结构中神经干细胞的自我更新等潜能，以及所形成的结构性单元的构架。为研究Axin2对神经干细胞自我更新的调控作用，我们将进一步建立“启动子驱动的单细胞基因敲除技术”。虽然Axin2负反馈调节Wnt-β-Catenin从而可能抑制细胞扩增，但我们的前期研究提示单细胞敲除Axin2反而抑制神经干细胞扩增。我们将进而利用RNAseq研究神经干细胞自我更新的新分子机制。此项目将帮助我们理解核团结构的形成、丘脑的发育及神经干细胞的永生化。

本项目探索了大脑核团发生的基本原则、神经干细胞的基本属性、神经元多样性发生的基本规律和分子调控机制。大脑皮层分为层状结构与核团结构，层状结构的形成基于“放射状单位假说”，而结构柱同时也是功能柱的概念也获得了1981年的诺贝尔生理医学奖，然而我们至今对核团结构形成的基本原理所知甚少。我们建立了单细胞谱系追踪（即克隆分析）等技术方法体系，揭示了丘脑内核团结构发生的时空调控原则，为破解核团结构的组织原则奠定了基础；绘制了下丘脑发育谱系树，提出了“级联放大模型”以阐明下丘脑神经元多样性发生的基本规律，有助于理解下丘脑的动态发育过程及高度多样化的神经元的命运决定，为治疗厌食、嗜睡、失眠等下丘脑相关神经系统疾病提供必要的研究基础和新思路。我们还进一步基于双标记镶嵌分析系统（MADM）开发了Driver-driving MADM-based genetic Deletion（DMAD）系统，并应用于探究胚胎神经干细胞的属性，发现了Axin2与p53以串并联方式驱动神经干细胞竞争进而调控大脑的大小，为研究神经疾病、创伤和衰老背景下的大脑大小控制和神经元脆弱性的发育起源开辟新途径。该项目还对下丘脑成体神经干细胞的分子细胞属性以及中心体完整性对大脑皮层胚胎神经干细胞的顶端粘附和自我更新属性的调控机制进行了探索。研究成果在《Cell Stem Cell》、《Nature Communications》、《Cell Reports》、《PLoS Biology》、《Cell Regeneration》、《Journal of Endocrinology》和《Journal of Genetics and Genomics》等杂志上发表论文7篇，在国内外学术会议上做专题报告7次，展示墙报4次。毕业博士研究生1名，硕士研究生1名，出站博士后1名。

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