CIC3-dynamin-1信号通路在神经突触囊泡胞吞过程中的作用及调控机制研究

结题报告

项目介绍

AI项目解读

基本信息

批准号：
30901631
项目类别：
青年科学基金项目
资助金额：
20.0万
负责人：
彭镜
依托单位：
中南大学
学科分类：
H0912.神经退行性变及相关疾病
结题年份：
2012
批准年份：
2009
项目状态：
已结题
起止时间：
2010-01-01 至2012-12-31

项目参与者：
尹飞； Yinzhaohong；吴丽文；杨丽芬；段元冬；何芳；肖朝华；
关键词：
胞吞突触囊泡 Dynamin-1 CIC3 调控

项目摘要

本项目利用RNAi技术、质粒转染等方法建立增强表达和抑制表达CIC3的大鼠海马神经元细胞模型，结合免疫沉淀、激光扫描共聚焦显微技术、膜片钳等研究策略，以神经元突触囊泡胞吞过程为研究对象，深入诠释突触囊泡再循环细节以及生理调控方式和位点。本研究首次证实CIC3是dynamin-1的分子伴侣（binding partner），并提出CIC3-dynamin-1信号通路通过磷酸化/去磷酸化作用调节突触囊泡的胞吞过程，且该通路与癫痫样放电密切相关。对突触囊泡再循环与CIC3和dynamin-1改变关系的研究，有助于我们对突触活动的深入了解，为临床难治性癫痫的治疗打开了新视角，提供了新思路。

结项摘要

本项目利用RNAi技术、质粒转染等方法建立增强和抑制表达CIC3大鼠海马神经元细胞模型，结合免疫沉淀、激光扫描共聚焦显微技术、膜片钳等研究策略，以神经元突触囊泡胞吞过程为研究对象，深入诠释突触囊泡再循环细节以及生理调控方式和位点。. 本研究首先利用氯化锂－匹罗卡品诱导建立内侧颞叶癫痫（MTLE）大鼠模型，采用比较蛋白质组学方法，发现dynamin-1可能与MTLE大鼠急性发作及慢性自发痫性发作均有着密切关系。利用免疫组化、Western Blot等方法证实在MTLE大鼠模型中，磷酸化dynamin-1蛋白在MTLE患儿及MTLE大鼠出现痫性发作期间表达下调，而dynamin-1总蛋白在MTLE大鼠各期、MTLE患儿及对照组海马之间表达无明显差异。提示dynamin-1可能通过磷酸化/去磷酸化方式参与了MTLE的发生发展。进一步利用体外癫痫细胞模型中导入dynamin-1的抑制剂dynasore，可以显著抑制突触囊泡的胞吞作用，减少痫性放电的数目及幅度，证实了dynamin-1在癫痫发生发展中的作用。然后通过构建dynamin-1-GST重组融合蛋白，利用Pull down联合质谱技术筛选、鉴定，发现氯离子通道蛋白CIC3为dynamin-1的相互作用蛋白，并提出CIC3-dynamin-1信号通路可能通过磷酸化/去磷酸化作用调节突触囊泡的胞吞过程。. 为进一步探讨其机制，本研究用过表达（full-length CIC-3）及抑制型CIC-3（CIC-3-shRNA337）质粒进行转染，利用转铁蛋白标记突触囊泡的胞吞。在CIC-3过表达状态下，dynamin-1磷酸化未受明显影响；而CIC-3被抑制时，dynamin-1磷酸化减少(去磷酸化状态)，活性增加，提示CIC-3与dynamin-1的活化呈负相关。胞吞和膜片钳实验中，抑制CIC-3后，胞吞量明显增加，癫痫样放电数目和幅度均有增加；而抑制dynamin-1GTPase酶活性的情况下（磷酸化状态），再抑制CIC-3的表达，胞吞量及电生理较对照组无明显变化，从而证实了CIC-3通过调控dynamin-1参与了突触囊泡胞吞。. 本研究结果显示CIC3-dynamin-1信号通路通过磷酸化/去磷酸化作用调节突触囊泡的胞吞过程。对其的深入研究，将为难治性癫痫的治疗打开新的视角，提供潜在的治疗靶点。