新型TIRFM成像技术用于活细胞中GLUT4囊泡转运的时空调节机制研究

Insulin stimulated GLUT4 translocation plays a pivotal role in glucose uptake and metabolism in humans. To date, the key machinery for regulation of GLUT4 vesicle trafficking has been identified, but without potent optical nanoscopy methods, the spatiotemporal regulation mechanism of vesicle trafficking has been challenging to be resolved. In this study, we applied the novel multi-angle ring TIRFM system we established in the lab, with enables evenly ring illumination and rapid multi-angle TIRF switch. With sophisticated 3D reconstruction and single particle tracking methods, we sought to visualize the protein dynamics within hundreds of nanometers near the plasma membrane of living adipocytes in 3D. Through the real time recording of the dynamics of tether protein exocyst (with exocyst knockdown and mutation) and GLUT4 vesicles near the plasma membrane, and reconstruction the process in 3D, we ought to reveal the mechanism of exocyst in spatiotemporal regulation of GLUT4 vesicle docking and fusion in adipocytes. Furthermore, the established methodology in this proposed study can serve as a general method for studying of other cell biology questions.

胰岛素刺激下的葡萄糖转运蛋白(GLUT4)囊泡的膜转位在机体葡萄糖代谢中发挥重要的作用。目前为止，众多直接参与GLUT4囊泡运输过程调控的重要蛋白质先后被发现。但是，由于缺少有效的实时纳米成像技术，对于它们调控囊泡转运的时空动态信息的获取仍然比较缺乏。本研究应用课题组所建立的新型环状多角度照明全内反射荧光显微(TIRFM)层析成像技术，利用激光的多角度快速环状分布照明与多角度TIRFM图像的三维重构及单粒子追踪方法，对脂肪细胞细胞膜附近几百纳米区域内的荧光分子的动态实施三维纳米成像。通过对囊泡锚定因子exocyst蛋白，及其敲减或突变等作用下，与GLUT4囊泡在膜区三维动态活动的分析，揭示exocyst蛋白调控囊泡锚定与融合的时空调节机制。此外，本研究建立的技术与方法同时也为细胞生物学的其他科学问题的研究提供一种通用的观测手段。

囊泡的转运和融合涉及多个步骤和复杂的蛋白质相互作用。很多蛋白质的作用时间以及作用位点目前都尚不明确。其中主要的技术难题是无法实现在活细胞中以较高的时间和空间的分辨率来清晰的记录并且分析GLUT4囊泡转运及参与调控蛋白分子的动态实时活动情况，因而也就很难揭示其具体的分子调控机制。本课题研究建立了环状多角度照明TIRFM层析成像技术及对应的图像处理及重建方法，实现高速、高分辨率细胞近膜区几百纳米区域内蛋白分子的动态成像，揭示了GLUT4囊泡的锚定与融合的时空调节机制以及Exocyst蛋白亚基在肿瘤细胞迁移和上皮间质转化中的重要作用，为以后深入研究糖尿病和癌症等提供一定的科学基础。此外，通过本课题的研究，课题组及团队成员发表了20余篇SCI收录论文，申报了4项专利，并培养了一支能从事多学科交叉研究工作的科研队伍。

内容获取失败，请点击重试