X连锁遗传性铁粒幼细胞性贫血新致病基因鉴定及功能研究

Sideroblastic anemia (SA) is a group of anemia characterized by iron accumulation in perinuclear mitochondria due to impaired iron utilization. There are two forms of sideroblastic anemia，inherited and acquired sideroblastic anemia. So far,seven genes are responsible for inherited sideroblastic anemia，but still nearly half of the cases did not find disease-causing mutations. In the early experimental work, we had analysised two cases of family SA patients with known familial SA gene mutations, gene mutations were not found. So whole-genome sequencing were carried out in two SA cases. The next issue will be，by utilization of bioinformatics to analysis SA patients gene sequence found in our preliminary work by comparison with the human genome data to find novel SA-related gene mutations. And further by in vitro transfection and building a mouse model to validate the gene function, study the role of the newly discovered the in hemoglobin formation and iron utilization. At last, we will verify the reproducibility of the new discovered gene in the sporadic cases.

铁粒幼细胞性贫血（SA）为一组铁利用障碍所致的贫血性疾病，可分为获得性和遗传性两大类。迄今为止，在遗传性SA患者中已找到7种致病基因，但仍有近一半的病例存在未发现的致病基因突变。在前期的实验工作中，我们对2例家族性SA患者进行已知基因的突变分析，未发现致病基因突变，故对这2例SA患者进行了全基因组测序。在此基础之上，本课题组将综合利用生物信息学分析技术对前期发现的SA家系进行序列分析，通过与人类基因组数据对比，寻找与SA相关的新致病基因突变，并进一步通过体外转染和构建小鼠动物模型对所发现的新突变进行验证，从而研究新发现基因在血红蛋白形成及铁利用过程中所发挥的作用；同时对新发现基因在其他散发病例中进行重现性验证，由此可以进一步深入研究遗传性铁粒幼细胞性贫血的发病机制，以及血红蛋白的合成过程及铁代谢通路。

δ氨基γ酮戊酸合成酶2（5-aminolevulinate synthase 2， ALAS2）作为血红素合成过程中唯一一个限速酶，生理条件下在线粒体中发挥催化效应，参与血红蛋白的合成，ALAS2基因突变参与X连锁遗传性铁粒幼细胞性贫血的发病（X-linked sideroblastic anemia, XLSA），本研究前期收集到一个有6例男性患者的XLSA家系,通过鉴定可疑致病突变位点，结合染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP-qPCR）结果，发现改家系致病突变位点位于第1内含子上GATA1结合位点所在区域（int-1-GATA），荧光素酶报告系统证明突变位点所在片段对于ALAS2 启动子极有可能具有增强子作用。利用TALEN技术我们获得Alas2基因突变位点所在区域13bp片段缺失的F0代嵌合雌性小鼠1只。通过杂交繁育发现int-1-GATA位点纯合突变会导致小鼠胚胎致死。Alas2Δ13/Y卵黄囊来源细胞Alas2表达水平显著低于正常对照以及杂合雌性小鼠卵黄囊来源细胞，敲除小鼠来源卵黄囊红系细胞血红素合成受抑且出现明显的铁过载表现；流式及克隆形成实验提示红细胞比例严重降低，红系发育受阻于BFU-E及CFU-E阶段。ChIP-qPCR验证提示int-1-GATA位点破坏，不但影响Gata1本身在第1内含子上的结合，同时影响启动子上Pol II的结合，表明Alas2的转录启动受到抑制。在K562细胞系中利用3C技术证实在ALAS2第8内含子上也存在GATA1结合位点,且int-1-GATA与int-8-GATA借助GATA1蛋白的二聚体， LDB1、LMO2及TAL1骨架结构形成环状loop结构。利用CRISPR/Cas9技术分别敲除K562 int-1-GATA及int-8-GATA区域，发现敲除细胞系ALAS2表达水平显著低于野生型K562（wt），且int1Δ6 K562表达水平下降较int8Δ4 K562明显。我们发现的新突变位点在红系早期原始造血及后期红系发育中所起的至关重要的作用，为后续精确诊断XLSA及相关疾病提供理论支持，并为针对该位点的靶向治疗提供理论及实验基础。

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