猪miR-15b前体C58U突变对其表达的影响及其在T淋巴细胞发育中的功能研究

MicroRNAs play an important role in the generation, differentiation and immune response of immunity cells. The pre-miRNA mutations were proved to be an important genome variation that would generate serious diseases and phenotype changes. We previously identified a C/U mutation in the pre-miR15b decreasing the free energy of hairpin and stabilizing the pre-miRNA structure and might influence the expression of miR-15b. In this project, we first analyze the pri-,Pre-,and mature miR-15b expression level in wild and mutation type homozygotes in vivo and in vitro by qRT-PCR and Northern blot to explore the mechanism of the pre-miRNA mutation influence the expression of mature miRNA. Then we detect expression and location of miR15b in immune tissues and T-lymphocytes. And the T-lymphocyte subset and the immunosuppression function of nTreg cells of knockout and wildtype mice were identified by flow cytometry and mixed cultured methods. To investigate the underlying molecular mechanism, RNA-seq were conducted in wildtype and knockout mouse CD4+CD25+ cells. This study will benefit to clarify the function of miR-15b in the immunity system and lay a foundation for animal disease resistance breeding.

MicroRNA在免疫细胞的发生、发育以及免疫应答过程中都发挥着重要的作用，其前体序列突变被证实是一类重要的导致疾病和表型改变的基因组变异。本课题组在前期的基础上，发现与免疫细胞发育分化相关的miR-15b前体中的一个C/U突变引起了其自由能降低，极大地增加了前体序列的稳定性，可能影响了其表达和功能。本研究拟在细胞和个体水平上通过采用荧光定量PCR、Northern blot等方法对野生型和突变型miR-15b进行比较分析，探讨microRNA前体中的突变对成熟体及其表达量的影响机制；通过采用免疫荧光定位、细胞混合培养、流式细胞分析等方法，在细胞、个体、模式动物三个层面对miR-15b及突变在T淋巴细胞、特别是在对免疫系统有着重要调节作用的nTreg细胞中的功能进行分析，初步阐释miR-15b在T淋巴细胞发育、分化中的功能及其分子机制，为猪抗病育种提供理论依据。

MiR-15b是miR-15家族的成员之一，该家族参与调节人体多种重要功能活动，如凋亡、细胞周期调控、血管生成等，并与多种人类疾病。本课题组在前期研究发现miR-15b前体中的一个C/U突变引起了其自由能降低，极大地增加了前体序列的稳定性，并可能通过此影响了其表达和功能。我们通过构建野生型和突变型载体转染细胞对miR-15b的两个剪切成熟体5p和3p的表达量进行比较分析，发现该+58C>U突变可使主要成熟体miR-15b-5p的表达量下降，而次要成熟体miR-15b-3p的表达量上升，结果导致miR-15b的5p和3p的比值呈现出显著的变化。通过对miR-15b的前前体（pri-）和前体（pre-）的表达量进行比较分析发现，pri-miR-15b的表达量没有显著差异，但pre-miR-15b的表达量发生了显著的改变，因此，我们推测该突变可能通过影响miRNA的Pri-到Pre-过程的剪切加工最终影响了成熟体miR-15b的表达。因此，我们推测，前体序列中该+58C>T突变可能通过影响了Ago蛋白对链的选择性，使之更多的选择结合miR-15b-3p形成RNA诱导的沉默复合体而免于被降解，从而使检测到的miR-15b-3p的表达量增高，miR-15b-5p和-3p的相对比例改变。为了进一步探究miR-15b的功能，我们对miR15b在荣昌猪各组织中的表达量进行检测发现，其在胸腺中的表达量最高，其次是心脏。对预测到的miR-15b靶基因进行GO注释及KEGG富集分析发现，miR-15b参与了多种重要的生物学功能。利用双萤光素酶报告系统进行进一步的靶基因验证，发现CD28为miR-15b的靶基因，提示miRNA-15b可能会通过靶向CD28参与T细胞的免疫应答过程。为了进一步探究miR-15b在T淋巴细胞中的功能，我们引进了miR-15b/16-2敲除鼠冷冻精液进行繁殖。遗憾的是，尽管我们经过多次反复的杂交实验，均未能得到miR-15b的敲基因纯合子小鼠，且产出的纯合子和杂合子个体偏少（4-9个）。在我们对孕鼠进行解剖发现，小鼠胚胎在第九天之后一些个体开始逐渐死亡，到第14天死亡的胚胎完全消失。因第10-13天正是小鼠胚胎心脏发育关键时期，结合我们前期表达谱结果，我们推测miR-15b可能为心脏发育的一个关键调节因子，它的缺失可能直接导致了小鼠胚胎的死亡。

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