中国苏南地区人群负性共刺激分子基因多态性与HCV感染转归关联性研究及其介导ARFP作用的分子机制研究

A newly discovered protein, hepatitis C virus (HCV) ARFP(alternative reading frame protein, ARFP), which was encoded by an alternative+1 reading frame overlapping the core genomic region, has been proved to be associated with chronic HCV infection and hepatocellular carcinoma in lots of researches. Based on the reports and our previous findings, we tentatively put forward that HCV ARFP may exert its immunoregulations by ways of inhibitory molecules, and result in continuous low levels of immune response and impaired cytotoxic T lymphocytes, which lead to the development of chronic HCV infection and even hepatocellular carcinoma (HCC). In order to verify this hypothesis, several experiments are to be performed. Well-designed case-control and case-case epidemiological studies and functional studies are to be carried out to detect the genetic polymorphisms and expression levels of inhibitory molecules for the HCV associated biomarkers in Chinese Han population. Adenovirus expression system of HCV ARFP is intended to explore its regulation in immunocytes with variable genotypes of inhibitory molecules and its involved signal pathways. We also mean to make a thorough inquiry into the restoration of the immunocompetence in patients with differential genetic backgrounds by single and combined inhibitory signal blockade. Findings in this project may help to shed light on the mechanisms of susceptibility and outcomes of HCV infection in Chinese and provide reference for the prophylactic and therapeutic treatment of HCV-associated diseases.

HCV ARFP是近年新发现的一种由结构基因core发生读码框移位形成的产物，与HCV感染慢性化和肝癌的发生发展密切相关。在国内外以及本课题组前期研究的基础上, 我们提出可能的机制是ARFP通过负性共刺激分子发挥免疫抑制作用，致使机体免疫应答持续低下，细胞毒性T细胞活性降低，最终导致HCV感染慢性化和肝癌发生。为验证此假设，拟采用病例-对照和病例-病例研究设计和SNP分型技术，检测不同HCV感染结局人群（自限清除，慢性感染，肝硬化和肝癌）负性共刺激分子基因多态性和表达水平，筛选出与中国汉族人群HCV感染相关的负性共刺激生物标志物分子；构建ARFP腺病毒表达体系，考察ARFP对具有不同负性共刺激分子基因型免疫细胞的调控作用，并探究其作用的信号途径；探索通过单一抗体和联合多抗体阻断抑制性信号的方法恢复不同基因型免疫细胞功能的个性化策略。预期研究成果对HCV感染的预防、治疗和预后具有重要意义。

本课题已按研究计划完成。 .丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是一种直径小于80nm的单股正链RNA病毒。HCV病毒感染机体后，有相当一部分的患者表现出免疫功能抑制，导致病毒持续攻击免疫系统，进而发展成慢性化感染，甚至肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌等终末期肝病。有研究表明，F蛋白可能是HCV在宿主免疫调控压力下的一个新的生存策略，而不是一个偶然意外的突变产物。F蛋白的产生可能诱导病毒感染持续甚至恶性转化。为分析病原-基因-免疫-环境因素之间的交互作用，本课题采用分子生物学学，病毒学和分子流行病方法开展研究，取得以下重要研究结果：1. 负性共刺激分子Tim-3信号通路在影响HCV感染的免疫应答中与F蛋白存在相关性，Tim-3的表达与F蛋白的产生可能均为引起HCV感染的危险因素。2. 负性共刺激分子Tim-3基因rs13170556 位点 C较野生型位点T能显著增加HCV慢性感染的风险；年龄与性别可影响不同位点的负性共刺激分子Tim-3基因多态性的基因型频率。3. 阻断负性共刺激分子 2B4信号通路，HCV感染患者PBMCs Th1类细胞因子表达上调，细胞免疫应答强度增强，Th2类细胞因子表达下调，体液免疫应答强度减弱，可能有利于病毒清除，减缓感染的慢性化进程。4.负性共刺激分子PD-1基因rs10204525位点的多态性影响机体HCV感染的结局；rs10204525 TT基因型与较高的PD-1+ T细胞比例呈显著相关性；rs12979860 CC & rs10204525 TC+C C基因型的HCV患者可以较高概率的获得自限清除。5. IL-28B rs12979860 与 PD-1（rs10204525）之间具有显著的交互作用。.在本项目资助下，已发表论文 8 篇，其中 SCI 论文5篇。培养博士2 名，硕士生2 名。 .本课题的科学意义在于从群体和分子水平较深入地探讨了HCV ARFP、负性共刺激分子基因多态性和功能、T细胞免疫应答等在HCV感染慢性化以及肝癌中的作用及其相互关系，分析了病原-基因-免疫-环境因素之间的交互作用，为进一步开展个性化的HCV感染的预防和治疗提供了理论依据和临床研究资料。

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