泡沫逆转录病毒cPPT元件结构分析及其在DNA合成和核内运输过程中的功能研究

泡沫病毒(FV)是一类无致病性的特殊逆转录病毒，在其基础上构建的载体具有安全性高、可实现外源基因长期稳定表达等优点。但是目前泡沫病毒分子生物学研究滞后于MLV、HIV等，对其独特而复杂的复制过程认识不足，导致现有的FV载体存在包含大量野生型病毒序列的缺点，影响载体的安全性和包装容量。本项目拟利用野生型泡沫病毒和已建立的HFV载体系统，对病毒pol基因3′末端顺式序列，采用基因缺失、定点突变等方法构建系列cPPT突变体，检测这些突变体的转录效率、包装效率和外源报告基因的表达效率，确定启始（+）DNA合成的cPPT及形成gap的起始、终止核苷酸和精确长度；探讨cPPT在（+）DNA合成过程中对抗细胞先天抗病毒防御因子-APOBEC3的DNA编辑作用以及在病毒双链DNA核内运输过程中的功能；研究cPPT元件在泡沫病毒载体中的功能必要性和可替换性。进一步阐明泡沫病毒独特复制机制和改进泡沫病毒载体。

泡沫病毒（FV）是一类无致病性的特殊逆转录病毒，在其基础上构建的载体具有安全性高、可实现外源基因长期稳定表达等优点。但是目前对FV独特而复杂的复制过程认识不足，导致现有的FV载体存在包含大量野生型病毒序列的缺点，影响载体的安全性和包装容量。人泡沫病毒（HFV）于1971年从肯尼亚鼻咽癌病人淋巴细胞中分离，序列比对揭示其与黑猩猩中分离的猴泡沫病毒SFVcpz有较高相似度；除了与非人灵长类紧密接触的人员（猎人、动物饲养员等）外，人类极少被FV感染；对FV感染者近30年的跟踪观察没有发现FV致病性，也没有发现FV人传人的现象。因此现在也称HFV为逆转录病毒科泡沫病毒亚科泡沫病毒属的原型病毒（prototype foamy virus, PFV）。前期研究表明FV的（+）DNA合成与HIV相同是从3′PPT和cPPT双启始的，新合成的（+）DNA是不连续的，但不同于HIV的（+）DNA不连续形成DNA重叠（flap），FV（+）DNA不连续形成的是gap。本项目运用生物信息学方法预测PFV关键序列和位点，利用实验室前期构建的PFV载体系统，确定了gap末端位置。gap的3′终止位点分布在PFV基因组5684 bp~6978 bp范围内的9个碱基，落在第三个和第四个断裂位点的频数分别为10/40和24/40；5′端的起始位点随机分布在6387 bp~6886 bp；不同位点频数在1/40~3/40不等。Gap的5′端和3′端位点均落于第4个cPPT元件两侧，证明第4个cPPT元件作为引物起始病毒（+）DNA下游的合成；同时确定gap断裂区的长度在142 bp~735 bp。采用基因缺失、定点突变等分子生物学实验方法构建cPPT突变体；随后通过同源重组法向cPPT突变体的pShuttle-cis系列载体中插入3′PPT元件，构建成pShuttle-gRNA系列载体包含泡沫病毒包装所有顺式作用元件。通过检测这些突变体外源报告基因表达效率，发现野生型PFV感染效率正常；HIV cPPT替代PFV cPPT后，所包装病毒感染后GFP有较少表达，说明病毒数量较野生型病毒大幅度减少；点突变或缺失cPPT序列后所包装病毒量更低，几乎检测不到。由此说明cPPT序列对病毒毒粒包装有不可替代的作用。本研究进一步明确泡沫病毒独特的复制机制，为构建更安全的新一代病毒载体奠定理论基础。

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