热休克表达系统克服重组蛋白形成包涵体的分子机理研究

Many recombinant proteins can be expressed in Escherichia coli. The use of E. coli for protein expression is well documented for its advantages of low cost, high protein yields and easy transformation. However, solubility may be an issue, since some proteins are insoluble and aggregate in inclusion bodies. Our preliminary experiments showed that soluble expression of an aggregation-prone fungal xylanase has been achieved using pHsh-ex-xynA2 expression vector by heat shock induction. In order to reveal the basic molecular mechanisms involved in protein aggregation, our main research interests are mainly focused on: 1) to analyze the mechanism of changes in the concentration of σ32 in cells harboring pHsh plasmid with genetic and biochemical techniques; 2) to characterize the expression levels of heat shock transcription factors and molecular chaperones in cells harboring pHsh plasmid with two-dimensional electrophoresis and FQ RT-PCR; and 3) to study the effect of periplasmic chaperones on soluble protein expression with gene co-expression and gene knockout technology. We believe that our investigations will primarily reveal the molecular mechanisms involved in protein aggregation and the formation of inclusion bodies; and further, we intend to develop a novel strategy and technology to overcome the inclusion body formation in E. coli.

大肠杆菌表达系统因操作简单，遗传背景清楚，目的基因表达水平高，重组质粒易于转化等优点，倍受人们重视。但大肠杆菌过量表达重组蛋白时易形成包涵体，从而阻碍了生物医药蛋白的大量生产。采用热休克表达载体在周质空间表达真菌来源的木聚糖酶时，我们成功地避免了包涵体的形成，获得了重组酶的可溶性表达。本项目拟采用遗传和生化方法，研究细胞中导入热休克表达载体时，引起胞内σ32浓度变化的分子机理；同时采用双向电泳方法和荧光定量RT-PCR方法，研究热休克表达载体介导外源基因高效表达期间，胞内热激转录因子和分子伴侣表达水平上的变化规律；通过基因敲除和共表达的手段，阐明周质空间热休克蛋白对分泌型重组蛋白可溶性表达的影响。研究结果将从分子水平上揭示引起包涵体形成的主要因素和化解方法，阐明热休克系统控制包涵体的功能，为无包涵体表达新技术的完善和拓展奠定理论基础。

大肠杆菌面对外界环境温度忽然升高时会产生热休克反应（heat shock response）。细胞中受热激转录因子调控的热休克蛋白被瞬间大量合成。大量产生的热休克蛋白主要包括分子伴侣，折叠因子，蛋白降解酶等。为了从分子水平上揭示热休克表达载体分泌表达重组酶时可以避免包涵体形成的机制，我们对热激转录因子sigma32和sigmaE及其调控的胞内和周质空间热休克蛋白进行了研究，已经明确：1）细胞中导入含有热激启动子的热休克表达载体pHsh时，胞内的sigma32浓度较其他细胞的更高；2）木聚糖酶与周质空间分子伴侣OsmY融合表达时，获得高水平可溶性表达；3）共表达热休克蛋白YgiW，DsbC 和 DnaK时，对木聚糖酶可溶性表达水平提高不明显；4）含有热休克表达载体的重组大肠杆菌中热休克蛋白基因IbpA，dsbC和热激转录因子基因rpoH和rpoE的转录水平都比对照的要高。此外，sigmaE主要负责调控周质空间热休克蛋白，构建的σE转录因子识别的启动子的表达载体pHsh-sE-XynA2，也可以通过热激诱导表达蛋白，说明在热休克反应过程中sigma32和sigmaE浓度都发生了变化，间接说明周质空间分子伴侣在蛋白折叠中起到重要作用。同时对蛋白分泌信号肽的分析，表明OmpC来源的信号肽比OmpA，OmpF和YgiW来源的信号肽更有利于重组蛋白的分泌表达。因此，热休克表达载体分泌表达重组酶避免包涵体形成，与细胞热休克反应后胞内和周质空间一系列热休克蛋白的生化反应有着密切相关性。热休克分泌表达载体为大肠杆菌无包涵体表达新技术的完善和拓展提供理论基础。

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