鉴别布鲁氏菌野毒感染与疫苗免疫动物的血清核酸适配子的筛选及鉴定

Brucellosis, a major zoonosis, poses a severe threat to livestock and public health security. Accurate diagnosis is the key to control brucellosis. However, at present, the serodiagnosis failed to differentiate vaccinated from infected animals caused by Brucella. The results were that innocent animals were slaughtered or vaccinated and infected animals coexisted for ages. Controls of brucellosis were in trouble. Thus, how to distinguish vaccinated from infected animals caused by Brucella is the most urgent problem needed to be solved. Aptamers are single-stranded oligonucleotides that can bind to their targets with high affinity and specificity. The characteristics of aptamers are similar to monoclonal antibodies (McAb), sometimes even superior to McAb. Aptamers are not limited to their targets, so specific aptamers against any targets can be isolated theoretically. Serum contain abundant known or unknown biomarker. Hence, it will be a new strategy for differential diagnosis to screen specific aptamers against serum biomarker to serve as detection probe, easier to screen biomarker. Therefore, in this study, we plan to use infection serum as targets, and immune serum as subtractive targets to screen in high throughput aptamers that can specifically recognize infection serum nor immune serum in order to develop a new molecular probe for differential diagnosis of brucellosis.

布鲁氏菌病是一种重要的人兽共患传染病，严重威胁畜牧业和公共卫生安全。准确的诊断是控制布病的关键。然而，目前布病的血清学检测无法准确区分野毒感染和疫苗免疫动物，导致“错杀无辜”或免疫和感染动物长期共存，致使布病的控制困难重重。因此，如何鉴别布鲁氏菌野毒感染和疫苗免疫动物是亟待解决的问题。适配子是一类具有高特异性、高亲和力的单链寡核苷酸，其功能类似抗体，但某些特性优于抗体。适配子的靶标不受任何限制，理论上可筛选获得针对任意靶标的特异性核酸适配子。血清中蕴含许多已知或未知的诊断标志物，故以血清为靶标“盲筛” 针对未知诊断标志物的特异性适配子为检测探针，是用于疾病诊断的新策略，比筛选诊断标志物更为简单易行。因此，本研究拟采用消减SELEX技术，分别以布鲁氏菌感染和免疫动物的血清为筛选靶标和消减靶标，高通量筛选特异性识别感染动物而非免疫动物血清的核酸适配子，旨为布病的鉴别诊断提供新型的分子检测探针。

目前，如何鉴别布鲁氏菌感染与免疫动物是亟待解决的问题。由于缺乏有效的分子检测探针，致使布病感染与免疫动物无法辨别。因此，本项目针对该问题，开展了血清核酸适配体的筛选研究工作。研究结果如下：（1）设计合成了全长100 nt随机ssDNA文库，中间随机序列为58 nt，两端固定引物序列各为21 nt。分别以布鲁氏菌感染动物血清为筛选靶标，以免疫动物血清为反筛靶标，利用新型的纳米材料氧化石墨烯（GO）作为分离介质，首次尝试采用消减-GO-SELEX技术高通量筛选特异性识别感染动物血清的核酸适配体。根据ssDNA的回收率，分析核酸适配体的富集情况。结果表明：随着筛选轮数的增加，回收率不断上升。从第四轮开始，回收率上升趋于平缓，第六轮时回收率最高为79.26%，因此终止筛选。（2）分别选取第四、五、六轮文库进行高通量测序，每轮测序获得的原始数据均>5.6×106. 利用Cutadapter软件，根据文库序列长度及引物序列对原始数据进行过滤，最终每轮获得了约2-4×104 唯一序列。利用FASTAptamer软件，根据每条序列在两轮之间的浓度比值即富集倍数，筛选出前30条高富集倍数的候选序列。利用mfold软件预测分析序列的二级结构，根据结构特征、最小自由能原则，最终筛选了SA.1(R6/5)、 SA.2(R6/5)、SA.3(R6/5)、SA.1(R5/4)、SA.2(R5/4)、SA.3(R5/4)、SA.2(R6/4)、SA.3(R6/4)进行特异性及亲和力验证。（3）利用AuNPs比色法进行特异性检测。在最优的NaCl和适配体浓度的条件下，分别检测适配体对布鲁氏菌健康组、疫苗组及感染组血清的特异识别能力，结果表明，候选适配体对感染组及疫苗组的血清均有不同程度的识别能力，无法区分感染与免疫动物血清。（4）由于目前尚未发现特异性较强的核酸适配体，因此尚未进行进一步的亲和力检测。

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