调节性T细胞体外扩增及细胞移植对脑缺血损伤后神经血管单元重建的影响

Recent studies reveal that cerebral ischemia elicits a profound inflammatory response. Overactivated peripheral immune cells panetrated to the brain paranchyma and not only severely impact stroke pathology in the early stage after ischemia but also hinder the neuronal repair in the long term. In our previous study, we found that tranplantation of natural occuring regulatory T cells(Tregs) could protect against the disruption of blood brain barrier and cerebral inflammation following ischemia. Because Tregs only account for 5% of total T cells, to obtain enough Tregs, we intended to expand Tregs ex vivo in this study. Using long term behavirial tests and brain infarct volume quantification, we will evaluate the neuroprotective effect of transplantation of ex vivo expanded Tregs in cerebral ischemia in mice. Reconstruction of neurovascular unit is recently implicated as an important process in the long term brain repair following ischemia. Cerebral inflammation was evidenced as a negative factor in the reconstraction of neurovascular unit. Therefore, in this study, we would like to test whether the long term protection afforded by Treg transplantation was mediated by inhibiting cerebral inflammation and subsequant enhanced neurogenesis and angiogenesis, which are two major components of neurovascular unit reconstruction. In this study, we will assess the neurogenesis and angiogenesis using immununofluorescence staining and confocal microscopy imaging in severe combined immune difficiency (SCID) mice or neurophil depleted mice. Hopefully, these experiments will reveal the potential mechanisms involved in the long term protection afforded by Treg transplantion in cerebral ischemic injury.

近期的研究发现脑缺血损伤以后脑内以及外周过度激活的免疫炎症反应不仅是早期神经功能损伤的重要致病因素，而且给后期神经功能的修复带来了极大的阻力。我们以往的研究发现通过移植小鼠自然形成的调节性T细胞可抑制脑缺血再灌注损伤后的血脑屏障破坏，从而抑制免疫炎症反应，可起到早期的神经保护作用。由于体内本身具有的自然形成调节性T细胞数量十分有限，本研究拟采用离体细胞体外扩增的方法获得更多数量的高纯度调节性T细胞。 通过长达28天的动物行为学测试以及脑梗死体积测定，验证离体扩增的调节性T细胞移植是否可对脑缺血损伤具有长期的神经保护作用。应用免疫荧光染色，激光共聚焦立体成像等技术，在重症联合免疫缺陷小鼠以及抗体中和中性粒细胞的小鼠中研究脑缺血后的神经血管单元重建，从而进一步深入地探讨脑内炎症反应与脑缺血后神经血管单元重建之间的关系，揭示离体扩增的调节性T细胞移植对脑缺血保护作用的潜在作用机制。

缺血性脑卒中(ischemic stroke)已跃居为我国人口致残及死亡原因的第一位，且发病有逐年增多的趋势。由于溶栓治疗具有严格的治疗时间窗限制（发病后 3-4.5 小时），故仅有极少数的缺血性脑卒中病人可得到有效治疗，绝大多数病人遭受神经功能缺损问题。而针对脑卒中后期神经功能修复目前仍缺乏有效的治疗策略。本课题通过提取自然形成的调节性T细胞（Treg），通过离体细胞培养的技术，发现Treg细胞可以在体外被增殖，从而获得比原本多出8倍多的细胞用于缺血性脑卒中的细胞治疗。通过流式细胞术鉴定技术，我们发现这些体外扩增的Treg细胞的纯度高达84%。这对于解决Treg细胞治疗的细胞来源问题具有重大的研究意义。Treg细胞在体外进行扩增后输注给大脑中动脉阻塞（MCAO）的脑卒中小鼠，发现体外扩增的Treg细胞移植后可减小脑梗死灶的体积，减轻脑白质损伤并减轻神经功能的缺损。我们采用Brdu标记新生细胞的方式，在小鼠处死前5天注射Brdu，使其能被新生细胞摄取后进入新生细胞，并且采用免疫荧光双重染色的方法，将Brdu与DCX,一种新生神经元的标记物以及NeuN,成熟的神经元标记物分别来进行标记。结果发现，Treg扩增虽然美誉显著改变新生的神经元(Brdu以及DCX双阳性细胞)的数量，但是Treg扩增显著增加了Brdu与成熟神经元标记物NeuN双阳性细胞的数量。本研究的科学技术意义在于，验证了离体扩增Treg细胞用于脑卒中治疗的可行性，并探索其作为一种负性调控中风后神经炎性反应的细胞治疗方法的新的作用靶点及作用机制，为以离体扩增Treg为基础的中风免疫细胞治疗的开发以及临床转化打下实验基础。其应用前景包括：1）首次提出将Treg这种免疫调控细胞用于中风的治疗，并在体外进行Treg的细胞扩增，以获得有效的治疗细胞数。此策略可显著增强Treg移植治疗的临床可转化性。2）提出Treg移植治疗可通过抑制免疫炎症反应促进脑缺血损伤后长期的神经修复。3）提出神经血管单元的重建是离体扩增Treg治疗脑缺血后期神经功能恢复的潜在治疗靶点。

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