血影蛋白αⅡ与肌动蛋白作用维持静纤毛稳定

In previous study, we identified a Myosin VI interactive protein, spectrinαII. Then we studied the cellular and subcellular distributions of spectrin αⅡ by immunofluorescence analysis using confocal microscopy and found spectrin αⅡ is strongly expressed in the region of cuticular plate , and especially around the rootlets of stereocilia of inner and outer hair cells, suggesting that spectrin αⅡ plays an important role in maintaining the structure of stereocilia. However, it needs to further confirm this role and it is unclear whether mutation in spectrin αⅡ can lead to hearing loss. In this project, we are going to down regulate spectrin αⅡ gene by talen technique in vitro cultured basilar membranes, and observe the morphological changes of hair bundles of inner and outer hair cells. Then, we will observe morphological changes and auditory funtion in spectrin αⅡ mutant mouse. At last, we will down regulate spectrin αⅡ in Zebrafish and observe the development changes of neuromast and inner ear, otolith formation and hair bundles. This project is aimed to identify the action between spectrinαⅡ and actin, and explore the role of sepctrinαⅡ in maintaining the stability of hair cells apical structure. The implementation of this project helps to uncover the role of spectrinαⅡ in stereocilia stability, which will provide cues for the prevention and treatment of stereocilia dysfuntion related sensorineural hearing loss.

肌球蛋白VI基因突变导致毛细胞静纤毛异常和感音神经性聋，静纤毛是以β和γ肌动蛋白为骨架。本课题组前期进行了内耳毛细胞肌球蛋白VI相互作用蛋白的研究，通过免疫共沉淀、质谱分析、Western blot、免疫荧光技术等手段，发现血影蛋白αII与肌球蛋白VI作用，血影蛋白αⅡ与肌球蛋白VI和肌动蛋白在表皮板共表达，且血影蛋白αⅡ在静纤毛根部强表达，提示血影蛋白αⅡ参与维持静纤毛结构的稳定。然而血影蛋白αⅡ在静纤毛结构的维持和听功能中的作用尚不清楚。本课题拟研究血影蛋白αⅡ下调对体外培养基底膜肌动蛋白的表达和毛细胞静纤毛的影响，并拟利用突变小鼠和斑马鱼基因敲除模型研究血影蛋白αⅡ下调对肌动蛋白的表达以及毛细胞形态包括静纤毛形态和听功能的影响。本课题旨在揭示血影蛋白αⅡ在内耳毛细胞静纤毛稳定中的作用，为防治静纤毛异常导致的耳聋提供理论基础。

我们的前期研究发现血影蛋白αII与肌球蛋白VI相互作用，与肌球蛋白VI和F-肌动蛋白在表皮板共表达，且血影蛋白α Ⅱ在静纤毛根部强表达，提示血影蛋白αⅡ参与维持静纤毛结构的维持。本项目主要进行了血影蛋白α Ⅱ在静纤毛结构和听功能维持中作用的研究。在本研究中，我们利用Cas9/RNA 基因编辑技术建立Sptan1基因条件敲除小鼠以及通过RNA干扰技术下调HEI-OC1细胞血影蛋白αII的表达，并进行了形态学、分子生物学和听觉电生理研究。结果发现：1）血影蛋白αII mRNA和蛋白表达在P1和P3相对高表达，P7及P30表达减少；采用免疫荧光技术检测不同时间点血影蛋白αII在耳蜗毛细胞的表达情况，发现其主要在表皮板和细胞膜内侧表达。2）利用Cas9/RNA 基因编辑技术构建 Sptan1-flox小鼠，Sptan1f/f小鼠与Gfi1-cre小鼠杂交，产生本研究用小鼠，即对照组小鼠为Gfi1-cre-/ +；Sptan1f/+， 实验组小鼠Gfi1-cre-/ +；Sptan1f/f。3）在P30行听性脑干反应（ABR），复合动作电位（CAPs）和畸变产物耳声发射（DPOAEs）测试，发现实验组小鼠ABR、CAPs和DPOAEs均显著高于对照组小鼠。4）通过免疫荧光技术和扫描及透射电镜技术观察P1、P3、P7、P15和（或）P30毛细胞静纤毛和表皮板形态学的改变，静纤毛完整性破坏和极性紊乱。5）血影蛋白αII缺失导致外毛细胞快速进行性死亡，外毛细胞区域大量Caspase3激活信号，细胞核碎片化，提示外毛细胞的死亡是通过凋亡途径实现的。6）血影蛋白αΙΙ下调HEI-OC1细胞形态异常、F-肌动蛋白分布异常和血影蛋白βII表达异常。7）静纤毛的缺失与血影蛋白αΙΙ相关，实验组小鼠蛋白表达正常，静纤毛正常，如蛋白低或无表达，则静纤毛形态异常。8）血影蛋白αΙΙ敲除影响血影蛋白βII和F-actin的表达。这些结果表明血影蛋白αII在毛细胞静纤毛和表皮板的发育和维持以及毛细胞存活的一个关键分子，提示血影蛋白αII对静纤毛的发育和维持以及耳蜗毛细胞的存活至关重要。

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