肝脏特异性表达人LPLS447X预防LPL基因缺陷型高甘油三酯血症急性胰腺炎的实验研究

Hypertriglyceridemia (HTG) has developed into the second leading cause of acute pancreatitis (AP) in China. It has been an crucial clinical object to reduce the plasma triglyceride level and prevent AP explosion. However, the conventional lowering-lipid therapy including fenofibrate had been found invalid for severe HTG caused by lipoprotein lipase (LPL) gene deficiency. Researches showed that gene therapy based on LPL beneficial mutation S447X was the most effective resolution for LPL-deficiency related HTG, while the existing targeted gene therapy has difficulty in clinical application due to the technology defects. We aim to construct a new liver-specific expression LPL-S447X vector, reduce HTG level and prevent AP explosion. In this project, we prepare to: ① construct and identify AAV8-LPL-S447X vector; ② assess the transfection efficiency and biosecurity of the AAV8-LPL-S447X in HepG2 cell line, wild type animals and two severe HTG animal models; ③ observe the effect of AAV8-LPL-S447X on plasma TG level and AP occurrence in two severe HTG animal models with spontaneous pancreatitis; ④ evaluate the effect of AAV8-LPL-S447X on the plasma chylomicron of LPL-deficiency patients, and the influence on the injury of primary pancreatic acinar cells. Our results will lay the theoretical and methodological foundation for clinical gene therapy.

高甘油三酯血症(HTG)是我国急性胰腺炎(AP)第二大病因，控制血浆甘油三酯水平、预防AP发病是重要的临床问题。脂蛋白酯酶(LPL)基因缺陷导致的重度HTG，非诺贝特等常规治疗无效，研究表明最有效方法是基于LPL有益突变体S447X(LPL-S447X)的基因治疗，但现有技术存在严重缺陷，无法推广应用。本课题拟构建新型AAV8载体在肝脏特异性表达LPL-S447X，以达到降低HTG、预防AP发病的目的。研究内容：①构建、鉴定新型载体AAV8-LPL-S447X；②在人肝细胞HepG2、正常动物及重度HTG动物模型中验证载体的转染效率和安全性；③应用两种可自发AP的重度HTG动物模型，观察载体对血浆甘油三酯水平、AP发病的影响，证实载体的有效性；④体外验证载体对LPL基因缺陷型重度HTG患者乳糜微粒的清除作用，及其对原代胰腺腺泡细胞的影响。研究结果将为临床基因治疗奠定理论和方法学基础。

高甘油三酯血症（HTG）是导致急性胰腺炎（AP）反复发作的主要病因之一。降脂药物等常规治疗手段对基因缺陷导致的原发性HTG无效，而以AAV1为载体的基因治疗药物Glybera又存在价格昂贵、给药痛苦、降脂效果不佳等诸多缺陷，因此，如何有效改善LPL等遗传缺陷导致的HTG，并预防高甘油三酯血症急性胰腺炎（HTG-AP）反复发作是当前的研究重点。本项目率先构建肝脏特异性表达人LPL蛋白有益突变体S447X的重组AAV5-LPLS447X和AAV8-LPLS447X病毒载体，通过体内和体外实验验证该基因治疗载体的安全性和有效性，获得以下结论：.一、靶向肝脏表达的AAV5-LPLS447X重组病毒载体构建成功，构建技术方法成熟、稳定。.二、体外实验证明，AAV5-LPLS447X重组病毒载体对人肝细胞亲和力强，感染效率良好，感染后肝细胞可有效表达人LPL蛋白。.三、在野生型小鼠或基因缺陷动物的体内实验证实，AAV5-LPLS447X重组病毒载体对心、肺、肝、肾等主要器官无明显损伤作用，安全性可靠，感染后小鼠肝脏可高效表达LPL，感染效率良好。.四、肝脏表达LPL是Gpihbp1-/-小鼠哺乳期不发生HTG的关键。在Gpihbp1-/-小鼠和大鼠中，AAV5-LPLS447X重组病毒载体静脉注射治疗可显著提高血浆LPL浓度和活性，降低血清TG至正常水平，并有效减轻雨蛙素/高脂饮食诱导HTG-AP的严重程度，而肌肉表达LPL无显著降脂作用。在Lpl+/-小鼠中，AAV5-LPLS447X重组病毒载体静脉注射治疗则显著改善高脂应激造成的TG异常升高。以上结果说明肝脏表达LPL是改善原发性HTG，预防HTG-AP的关键所在。.五、在P407诱导的HTG小鼠模型中，AAV5-LPLS447X重组病毒载体静脉注射治疗可一定程度上降低小鼠TG水平，有效减轻HTG-AP严重程度，而AAV1-LPLS447X基因治疗对P407诱导的HTG小鼠无明显降脂作用，表明AAV5-LPLS447X重组病毒载体对继发性因素导致的HTG仍具有潜在治疗作用。.本研究首次提出通过肝脏特异性表达LPLS447X的方式进行降脂基因治疗，相比于Glybera，该病毒载体适应症更广，降脂效果更明确，给药方式更简单，相关药物已申请I期试验，未来将为广大HTG患者提供了安全、有效、易接受的治疗手段。

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