发展基因组超大DNA片段的连续克隆技术及应用
项目介绍
AI项目解读
基本信息
- 批准号:31770099
- 项目类别:面上项目
- 资助金额:55.0万
- 负责人:
- 依托单位:
- 学科分类:C0104.微生物遗传与生物合成
- 结题年份:2021
- 批准年份:2017
- 项目状态:已结题
- 起止时间:2018-01-01 至2021-12-31
- 项目参与者:周见庭; 王韬; 姜鹏; 吴荣海; 邵洋洋;
- 关键词:
项目摘要
Classic molecular biology develops Bacterial Artificial Chromosome (BAC) from F plasmid (100 kb) for cloning of DNA fragments up to 300 kb in the prokaryotic model organism Escherichia coli, which cannot satisfy the need of manipulation of megabase-sized higher eukaryotic genome super-family or microbial whole genome in the era of 'omics'-based science. This project aims to develop a new method for in vivo sequential cloning of megabase-sized DNA in E. coli. Four high-efficient functional elements are integrated in this method, including the replication origin VoriCII from Vibrio cholerae chromosome 2 (1.07 Mb), the TelN-tos telomere system from E. coli linear phage N15, the efficient site-specific DNA cleavage system CRISPR-Cas9, and the Lambda Red homologous recombination system. By integrating the above four elements, a new method will be developed for in vivo sequential cloning of megabase-sized DNA in E. coli. As two application examples of this method, the 957 kb human immunoglobulin heavy-chain variable region IgHV and the 1.03 Mb E. coli reduced genome MGE-syn1.0 (including 449 essential genes and 267 growth important genes) will be separately cloned.
经典分子生物学在原核模式生物大肠杆菌中发展的由F质粒(100 kb)衍生的细菌人工染色体(BAC)仅可容纳≦300 kb的外源DNA,难以满足组学时代对超大DNA,如高等生物基因组超大功能基因簇或微生物全基因组(≧1 Mb)的遗传操作需求。本项目拟发展在大肠杆菌体内连续克隆超大DNA片段的方法。该方法整合了4个高效功能元件,包括来源于霍乱弧菌2号染色体(1.07 Mb)的复制元件VoriCII,来源于大肠杆菌线型噬菌体N15的TelN-tos端粒系统,DNA定点切割系统CRISPR-Cas9,及来源于Lambda噬菌体的Red同源重组系统。通过有机整合这4个功能元件,设计了在大肠杆菌体内连续克隆超大DNA片段的方法。利用该方法将分别克隆957 kb的人类免疫球蛋白重链可变区IgHV基因簇和1.03 Mb的大肠杆菌简约基因组MGE-syn1.0(含449个生存必需和267个生长重要基因)。
结项摘要
发展基因组工程技术,尤其是超大片段DNA(Mb级)的克隆拼接技术,是研究微生物功能基因组、基因组人工设计改造、以及高等真核生物超大功能基因簇的关键技术难点。目前最常用的技术是利用真核酿酒酵母同源重组系统进行超大DNA拼接,但存在克隆DNA容易发生重组而不稳定、大片段DNA难体外分离纯化等问题而难以满足克隆基因组超大DNA片段的需求。. 本项目通过整合了4个高效元件,创新性地在原核大肠杆菌中发展了基因组超大DNA连续克隆的新方法。该方法可以高效克隆拼接异源DNA,对于超过100 kb的大片段DNA的拼接正确率仍能接近100%。作为技术的应用示范,利用该方法成功克隆拼接了1.07 Mb的人免疫球蛋白重链可变区IgHV完整基因簇。. 本项目同时探索研究了该方法用于拼接大肠杆菌自身序列来源的生存必需和重要基因,发现随着片段增大拼接效率出现显著降低,可能与天然染色体的同源序列对重组拼接的干扰有关。. 项目的研究成果为基因组水平的超大DNA遗传操作工程的研究提供新方法和新技术,克服了传统技术难以稳定克隆拼接高等真核生物超大功能基因簇的问题,为基因组的设计重构及功能研究提供了关键技术支撑。
项目成果
期刊论文数量(4)
专著数量(0)
科研奖励数量(2)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Creating a functional single-chromosome yeast
创造功能性单染色体酵母
- DOI:10.1038/s41586-018-0382-x
- 发表时间:2018-08-16
- 期刊:NATURE
- 影响因子:64.8
- 作者:Shao, Yangyang;Lu, Ning;Qin, Zhongjun
- 通讯作者:Qin, Zhongjun
CRISPR-Cas9 facilitated multiple-chromosome fusion in Saccharomyces cerevisiae
CRISPR-Cas9促进酿酒酵母多染色体融合
- DOI:10.1021/acssynbio.8b00397
- 发表时间:2018
- 期刊:ACS Synthetic Biology
- 影响因子:4.7
- 作者:Yangyang Shao;Ning Lu;Zhongjun Qin;Xiaoli Xue
- 通讯作者:Xiaoli Xue
A single circular chromosome yeast
单环状染色体酵母
- DOI:10.1038/s41422-018-0110-y
- 发表时间:2019-01-01
- 期刊:CELL RESEARCH
- 影响因子:44.1
- 作者:Shao, Yangyang;Lu, Ning;Qin, Zhongjun
- 通讯作者:Qin, Zhongjun
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