苯丙氨酸变位酶区域选择性氨化3-芳香丙烯酸的分子机制及酶分子改造

The phenylalanine aminomutase(PAM) can catalyze regioselective amination of 3-arylpropenoic acid at α and β site to synthesize the β-arylalanine with high additional value. However, the the products are mixture of α, β-arylalanine, which results form the low regioselectivity of PAM, and it is difficult to obtain highly pure β-arylalanine. Therefore, there is necessary to improve the regioselectivity of PAM using molecular modification. In order to successfully modify the enzyme, we first need to solve two key scientific problems concerning the molecular mechanism of adding ammonia and accurately identifying the sensitive domain which manipulate the regioselectivity of PAM. In this project, we plan to verify the adding mode of amino group and hydrogen proton by TaPAM from Taxus using NMR and GC/EI-MS, and adopt structure alignment and molecular docking to find out sensitive domain of which manipulate the regioselectivity. On this basis, the efficient screening method was designed to screen the mutant gene, the CAST mutagenesis technique was used to reshape the domain of TaPAM, finally fulfill the modification of TaPAM. The aim of this project is to resolve the industrial application bottlenecks of PAM and provide scientific basis and methodical reference for molecular modification of other enzyme.

苯丙氨酸变位酶(PAM)催化3-芳香丙烯酸不饱和双键区域选择性的加氨，用于生产高附加值β-芳香丙氨酸，但存在区域选择性低的缺陷，产物是α,β-芳香丙氨酸的混合物，难以获得高纯度的β-芳香丙氨酸，因而迫切需要对酶进行改造，提高区域选择性。为成功实现酶分子改造，首先需要解决加氨的分子机制及鉴定操控酶区域选择性的敏感部位这两个关键科学问题。本项目以来源于紫杉(Taxus）的苯丙氨酸变位酶(TaPAM) 为研究对象，利用NMR和质谱研究TaPAM催化反应中氨基和质子的添加模式，解析加氨的分子机制，并对酶的序列和结构进行比对，分子对接等，准确鉴定操控酶区域选择性催化的敏感部位及关键氨基酸残基。在此基础上，设计高效的突变基因筛选方法，利用CAST突变技术对操控酶区域选择性催化的关键部位进行重构，完成酶的分子改造。本项目旨在解决制约PAM工业应用的瓶颈问题，并为其它酶分子改造提供科学依据和方法学的参考。

苯丙氨酸变位酶（PAM）属于MIO（the 4-methyleneimidazol-5-one）家族酶，以MIO为内源性辅因子，催化3-芳香丙烯酸不饱和双键区域选择性的加氨加氢，工业上用于生产β-芳香丙氨酸，但存在区域选择性低的缺陷，产物是α,β-芳香丙氨酸的混合物，难以获得高纯度的β-芳香丙氨酸。为解决工业应用问题，需要对该酶进行分子改造提高酶的区域选择性。本项目解决了两个关键科学问题及解析酶区域选择性催化机制及探明操控酶区域选择性的敏感部位，在此基础上进行酶的分子改造。本项目分别以三种来源（Streptomyces maritimus、Taxus chinensis、Pantone agglomerans）的苯丙氨酸变位酶为研究对象，采用基因克隆、异源表达高效制备重组酶并进行性质表征，利用NMR和质谱研究PAM催化反应中氨基和质子的添加模式，解析酶的区域选择性催化的的分子机制，结果表明酶催化过程是底物α-苯丙氨酸的氨基与β位的pro-3R氢发生分子内交换，从而合成β-苯丙氨酸。通过对酶的序列和结构进行比对，分子对接等，准确鉴定操控酶区域选择性催化的敏感部位及关键氨基酸残基，结果表明酶活性中心455位的苯丙氨酸残基参加操控酶区域选择性催化过程，参与酶催化中间产物反式肉桂酸的羧基酸与酶活性中心的结合方式从而实现操控酶的区域选择性催化。在此基础上，成功对来源Taxus chinensis和Pantone agglomerans 来源的PAM进行分子改造，获得高区域选择性的突变体，区域选择性提高了近5.2倍，β-苯丙氨酸的产率达到83%。同时在研究过程中发现Taxus chinensis和Pantone agglomerans来源的PAM催化合成不同立体构型的β-芳香丙氨酸，并深入研究了催化合成各种构型产物的产率及影响因素。本项目为解决制约PAM工业应用问题提供了借鉴，并为其它酶分子改造提供科学依据和方法学的参考。

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