酿酒酵母合成人源血红蛋白过程中血红素供给调控机制研究

In recent years, with the wide medical and nutritional application of human hemoglobin, the development of an efficient biosynthetic method for the industrial production of human hemoglobin has become a hot spot in the fields of research and business. Although Saccharomyces cerevisiae has its unique advantages in the synthesis of human hemoglobin, the insufficient intracellular heme is the biggest bottleneck in the large-scale production of human hemoglobin. The fundamental reasons are the intracellular spatial obstacle during heme synthesis, the unclear rate-limiting steps in heme synthetic pathway and the imbalanced metabolic flux between the expression of human globin and heme synthesis in S. cerevisiae. In this project, based on the previous studies on metabolic engineering in S. cerevisiae and the successful enhancement of heme synthesis in Escherichia coli, the applicant will focus on the elimination of spatial segregation, the regulation of heme synthetic pathway and the metabolic balance of heme synthesis in S. cerevisiae. Applying the multi-enzyme assembly technology, CRISPR/Cas9 recombinant technology, promoter library for yeast and heme biosensor, the efficient synthesis of human hemoglobin will be achieved in S. cerevisiae. The results of this project will lay the foundation for the commercial application of human hemoglobin.

近年来随着人源血红蛋白在医疗和食品等领域的广泛应用，开发可工业化生产的、安全高效的人源血红蛋白生物合成方法已经成为科研界和企业界关注的热点。虽然酿酒酵母菌株在合成人源血红蛋白方面有其特有的优势，但辅基血红素合成量的不足是制约应用酿酒酵母大规模生产人源血红蛋白的最大瓶颈。其根本原因是酿酒酵母中血红素合成过程存在空间障碍、血红素合成途径中的关键限速步骤未经系统的分析和强化、人源珠蛋白的表达与血红素合成之间的代谢流分配不平衡。因此针对这些问题，在本项目中申请人将在前期对酿酒酵母代谢改造和血红素合成代谢调控等相关研究的基础上，进一步应用多种代谢途径多酶组装系统、血红素合成代谢调控策略、代谢流分析和生物感应器元件，对血红素合成空间隔离机制、血红素合成代谢调控机制、血红素合成代谢平衡机制开展系统的研究，实现人源血红蛋白在酿酒酵母中的高效合成。本项目的研究成果将为人源血红蛋白商业化生产和应用奠定基础。

人源血红蛋白（Hb）是以血红素为辅因子的四聚体蛋白质，作为具有携氧能力的主要功能蛋白质在医药和食品方面具有广泛的应用。利用酿酒酵母进行人源血红蛋白的异源合成是替代传统提取法以实现安全和可持续生产的理想策略。本项目以酿酒酵母CEN.PK 113-11C为研究对象，首先分别利用组成启动子TEF/GPD和诱导启动子GAL1/GAL10进行人源血红蛋白的表达，发现诱导启动子GAL1/GAL10的人源血红蛋白表达水平是组成启动子的12.0倍；建立了基于CysGA 荧光强度为检测指标的稳定型人源血红蛋白突变体高通量筛选策略，经过5轮迭代饱和突变获得理想的稳定型突变体蛋白Mut 5-2，其氧亲和力和天然蛋白Wild基本一致，TM值相比Wild提高了4.8℃，结构稳定性[GdnHCl]midpoint从Wild的1.5 M提高至1.9 M，在405 min时，其Met%相比Wild降低了2.1倍，表明蛋白稳定性和抗自氧化得到显著提高。其次，确定了血红素合成途径中的关键酶HEM1、HEM14和HEM15定位于线粒体，HEM13定位于细胞质，通过信号肽截断解除了血红素合成的空间障碍，通过多酶级联和HEM1的基因组多拷贝整合使得最佳菌株4TDH-1的血红素合成水平达到0.30 mg/L。进一步通过在4TDH-1菌株中表达稳定型血红蛋白Mut 5-2，4TDH-1-Mut 5-2的蛋白表达水平达到0.25 mg/OD600，是天然菌株CEN-wild的21.9倍，血红素含量%（mol/mol Hb）从CEN-Wild的28.9%提高至4TDH-1- Mut 5-2的50.2%，ATBS和AMB方法检测的含血红素的酶活力相比CEN-Wild分别提高了18.2倍和17.6倍。本项目发表 SCI论文7篇(其中，IF>10.0的论文3篇；5.0<IF<10.0的论文3篇)，申请发明专利3项，超额完成项目申报预期成果指标。本项目的研究成果将为人源血红蛋白的规模化生产和应用奠定基础。

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