通络止痛外治法通过调节外泌体介导的TLRs/NF-κB通路治疗膝骨关节炎的作用机制研究

Knee osteoarthritis (KOA) is a form of degenerative joint disease characterized by synovial inflammation and cartilage degeneration. We had confirmed that TLRs / NF-κB pathway-mediated synovial inflammation is an important pathological change of KOA and has a close relationship with cartilage degeneration in previous studies,and we had revealed that Tongluozhitong external therapy can inhibit the synovial inflammation by regulating TLRs / NF-κB pathway and play an important role in treatment of KOA. However, synovial cell inflammatory response in the cell and tissue transfer mechanism is not yet clear. Numerous researches revealed that exosomes are important carriers for the exchange of information and material between cells and tissues, and play an important regulatory role in the pathogenesis, progression and treatment of many diseases. Exosomes in the bone and joint disease research is also increasing year by year. In this study, we intend to study the role of synovial exosomes transport in mediating expression of TLRs / NF-κB pathway in synovial membrane and cartilage tissue in vitro and in vivo. Base on this mechanism, we will explore the therapeutic mechanism of Tongluozhitong external therapy by regulating synovial exosome-mediated TLRs / NF-κB pathway expression, reveal the mechanism of KOA, clear and definite Tongluozhitong external therapy target of KOA, make new explorations on the precise therapy of Traditional Chinese Medicine.

膝骨关节炎（KOA）是一种以滑膜炎症、软骨退变为主要表现的退行性骨关节病。我们前期研究证实，TLRs/NF-κB通路调控的滑膜炎症是KOA的重要病理变化，并与软骨退变有着密切联系；通络止痛外治法可以通过调控TLRs/NF-κB通路从而抑制滑膜炎症发挥治疗KOA的作用。但滑膜细胞内炎症反应如何在细胞、组织间传递机制尚不明确。大量研究表明，外泌体是细胞间信息交流、物质交换的重要载体，在诸多疾病的发病、进展及治疗过程中发挥重要调控机制，其在骨关节疾病方面的研究也在逐年增加。本研究拟通过体内外实验，研究KOA滑膜外泌体转运作用介导滑膜、软骨组织TLRs/NF-κB通路表达的病理机制，并在此基础上发掘通络止痛外治法通过调控滑膜外泌体介导的TLRs/NF-κB通路表达治疗KOA的治疗机制，深入研究KOA的发病机制，明确通络止痛外治法治疗KOA的作用靶点，为中医药精准治疗做出新的探索。

课题组在前期国自然基金的支持下完成了相应实验研究，证实DAMPs/TLRs介导的NF-κB炎症通路相关滑膜炎症反应在OA发病机制中的重要作用，且通络止痛外治法能够通过对DAMPs/TLRs介导NF-κB炎症通路相关0A滑膜炎症反应进行调控，将中医外治法治疗KOA的研究引入精准靶向治疗的方向。然而通络止痛外治法具体调控该信号通路的作用机制尚不明确，外泌体在此过程中发挥着怎样的作用需要我们进一步研究。基于此本课题通过体内外实验，进一步探索通络止痛外治法通过调节外泌体介导的TLRs/NF-κB通路治疗膝骨关节炎的作用机制。（1）外泌体介导的TLRs/NF-κB通路在KOA中的病理作用机制，不同程度KOA患者病变分级、VAS评分、Womac评分及关节液通路下游炎症因子情况与外泌体中信号通路变化具有相关性。（2）应用三种外泌体分离方法提取关节液外泌体，并进行比较。（3）应用荧光实时定量PCR和Western Blot检测家兔不同程度KOA模型中外泌体介导的TLRs/NF-κB炎症通路的表达情况。（4）KOA模型家兔滑膜外泌体富集液注入正常家兔关节腔及离体的滑膜、软骨细胞，检测滑膜、软骨中TLRs/NF-κB信号通路及胞IL-1β、TNF-α、MMP-13的转录和表达水平。（5）检测脂多糖（LPS）诱导的KOA滑膜细胞模型外泌体中TLRs/NF-κB 通路的表达情况。（6）通络止痛外治法分别对LPS、炎症外泌体诱导的KOA滑膜细胞中TLRs/NF-κB调控作用，并寻找调控靶点。验证了（1）三种提取方法均可以成功的提取关节积液外泌体，满足实验需求，超滤排阻色谱法法获得的外泌体质量相对较高。（2）滑膜外泌体中信号通路表达与KOA症状、危险因素及关节积液中炎症因子的表达具有显著相关性，在KL2级中显著高表达。炎症KOA滑液外泌体是KOA显著致病成分，能够对正常家兔及其滑膜、软骨细胞进行炎症感染，且能够激活其中的TLRs/NF-κB信号表达，产生炎症反应。（3）荧光实时定量PCR和Western Blot检测出不同程度KOA家兔模型外泌体中信号通路表达具有差异，中度模型KOA家兔表达最为显著，（4）通络止痛外治法中君药桂皮醛、白芍总苷以及复方冻干粉均能够对LPS及炎症外泌体诱导的KOA起到抑制作用，通过调控外泌体中TLRs/NF-κB信号表达，控制滑膜及软骨的炎症状态，从而起到治作用。

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