Myo3A 基因功能的研究及其相关人耳聋疾病动物模型的建立

哺乳动物的听力极为敏感，这是由于耳蜗外毛细胞的一种特殊放大功能。当声音传入内耳，声波引起耳蜗基底膜的轻微振动，从而引起外毛细胞静纤毛顶端的一种机械能- - 电能转换器（mechanoelectrotransduction,MET蛋白）的反应, MET蛋白能打开静纤毛顶端的离子通道，产生膜电位；膜电位的变化可进一步引起外毛细胞胞体上的电动蛋白产生更大的振动。因此在声音放大过程中，两种蛋白起着关键的作用：一种是把机械振动转换成电位差的MET蛋白；另一种是在电位差作用下产生更大振动的电动蛋白。关于电动蛋白Prestin功能的基础研究已经取得了很大进展，但 MET蛋白的成分至今仍不清楚。Myo3A是MET蛋白复合体成员的重要候选基因，本研究拟利用基因打靶技术对小鼠中的Myo3A基因进行敲除，然后对制成的突变小鼠进行一系列分析，从而阐明Myo3A基因的功能，并揭示Myo3A在人类疾病中突变致病的机理。

哺乳动物的听力极为敏感，这是由于耳蜗外毛细胞的一种特殊放大功能。当声音传入内耳，声波引起耳蜗基底膜的振动，从而引起外毛细胞静纤毛顶端的一种机械能--电能转换器（mechanoelectrotransduction,MET 蛋白）的反应, MET 蛋白能打开静纤毛顶端的离子通道，产生膜电位，膜电位的变化可进一步引起外毛细胞胞体上的电动蛋白产生更大的振动，从而把放大的信号传到大脑。 MET 蛋白的成分至今仍不清楚。Myo3A 是MET 蛋白复合体成员的重要候选基因。另外，Myo3A 突变引起人的耳聋疾病DFNB30。本研究拟利用基因打靶技术对小鼠中的Myo3A 基因进行敲除，然后对制成的突变小鼠进行一系列分析，从而阐明Myo3A 基因的功能，并揭示Myo3A 在人类疾病中突变致病的机理。我们首先构建了基因敲除载体，使用胚胎干细胞(ES)进行基因打靶，通过显微注射获得嵌合体小鼠，把高嵌合鼠和中度嵌合鼠分别于野生型鼠(C57BL/6)进行交配，获得了具有种系传递的突变小鼠（F1代小鼠）。把得到的F1代小鼠（杂合）雄鼠和雌鼠交配就得到了F2代纯合鼠，即Myo3A基因敲除的遗传工程小鼠。使用Myo3A抗体，对Myo3A基因敲除小鼠进行Western-blot分析，结果显示基因敲除小鼠没有Myo3A蛋白，说明我们得到了Myo3A完全基因敲除的小鼠。使用Prestin抗体对耳蜗整体铺片上的进行染色，发现耳蜗外毛细胞存在的丢失现象，在底回处外毛细胞的丢失更加明显。 使用听力检测仪对出生2个月的野生型小鼠和Myo3A基因敲除小鼠进行听力分析，结果显示，野生型小鼠听力阈值为32dB，而基因敲入小鼠阈值为56dB, 所以我们制作的基因敲除小鼠是一种听力严重下降的小鼠。分别对野生鼠和突变鼠进行染料吞噬实验，结果显示，与野生鼠相比，Myo3A基因敲除小鼠吞噬FM1-43和FM3-25两种染料的能力均有所下降。 对Myo3A 基因的功能，以及Myo3A 在突变致聋的机理的深入研究正在进行中。

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