金属硫蛋白MT1介导癌-睾丸抗原CT23影响肝癌恶性生物学行为的研究

In the previous study, we found that the malignant behavior of HCC cells was inhibited obviously by the down-regulation of CT antigen CT23, But too late to study its mechanism further. In previous experiment we have found that potential tumor suppressor protein, metallothioneins, MT1, and transcription factor, POU4F1, lowly express in hepatocellular carcinoma tissue and highly express in adjacent tissues; MT1 and POU4F1 significantly up-regulated after down-regulation of CT23 in liver cancer cell, while both of them were significantly decreased after CT23 overexpressed in normal liver cells. Since bioinformatics analysis suggested that POU4F1 is the promoting transcription factor of MT1, we proposed scientific hypothesis that "CT23 might regulate MT1 transcription through POU4F1 to regulate the malignant behavior of liver cancer". This project intends to study the effects of CT23 and MT1 expression on the malignant biological behavior of liver cancer and the mechanism of CT23 regulating MT1 from the animals, cancer tissue, cells, and the molecular level, by using RNAi, Chromatin immunoprecipitation(ChIP), luciferase assay and transplanted tumor assay. This project would provide new ideas and new targets for the study and therapy of liver cancer.

本课题组前期研究发现肝癌细胞中CT抗原CT23下调后恶性行为明显受到抑制，但未及深入研究其机制。前期实验发现肝癌组织中潜在肿瘤抑制因子金属硫蛋白MT1、转录因子POU4F1低表达而癌旁组织则高表达；肝癌细胞CT23下调后MT1、POU4F1显著上调，肝细胞中CT23上调后MT1、POU4F1显著下调。生物信息学分析提示POU4F1是MT1的促进性转录因子，故提出“CT23可能通过MT1影响肝癌的恶性行为，并通过POU4F1调节MT1转录”的科学假说。本项目拟利用慢病毒转染RNAi或Knockin、荧光素酶、染色质免疫沉淀和裸鼠成瘤等实验技术从组织水平、细胞水平、动物水平和分子水平上研究CT23与POU4F1和MT1的表达关系对肝癌恶性生物学行为的影响，以及CT23调节MT1表达的机制，为肝癌研究和治疗提供新思路和靶点。

CT23是一种癌-睾丸抗原，即CT23在人体正常组织中只在睾丸表达、而在癌组织中广泛表达。由于在人体正常组织中的限制性表达，CT23是一个非常理想的肿瘤免疫治疗靶标。但CT23影响肿瘤的发生、发展的机制尚不清楚。.经本项目研究发现：（1）MT1表达与肝细胞肝癌（HCC）发生、发展密切相关，CT23下调导致的细胞恶性生物学行为减弱是通过MT1上调来调节的，并通过影响MT1表达影响肝癌细胞体内成瘤；CT23作为转录因子直接与DNA结合的可能性不大，也不大可能通过POU2F1、POU4F1调节MT1F表达；（2）HCC癌组织中MT1基因缺失频率高（约50%），MT1功能异构体下调与MT1基因缺失相关，MT1基因缺失可能通过MT1X、TTK、BUB1、CYP3A4、NR1I2、CYP8B1等6个枢纽基因表达降低患者预后，肝细胞癌基因组拷贝数改变与临床病理结果相关；（3）CT23结合蛋白可能与细胞粘附与连接、RNA剪切、蛋白翻译和折叠、染色质重构等过程相关，通过实验证实CT23可能通过结合PRPF8、EFTUD2、EIF4A3、SRSF7和NCBP1等剪接复合体主要或辅助蛋白影响U5、EJC剪接复合体的组装和/或功能，进而影响HCC细胞的可变剪接（AS）来影响HCC细胞的恶性行为和HCC患者的预后。.在本项目研究实施过程中，培养博士和硕士研究生共5人，其中博士研究生1人、硕士研究生4人。此外，共发表专业期刊论文4篇，其中SCI收录3篇、中国科技核心期刊收录1篇。本项目的完成为CT23作为HCC治疗的靶标提供了一定的实验和理论依据。.然而，本项目研究结束后仍有诸多问题未解决，如：（1）HCC中主要的CT23蛋白异构体是什么？（2）CT23蛋白以什么结构域、哪些关键位点与EFTUD2、EIF4A3等结合（TFIIF-α和/或Kazal）？（3）CT23蛋白如何影响剪接复合体的结构（组装）和功能？（4）CT23通过哪些具体的AS事件影响HCC发生、进展？（5）MT1缺失如何造成MT1X、TTK、BUB1、CYP3A4、NR1I2、CYP8B1等基因表达变化？这些基因的表达变化怎样造成HCC患者的不良预后？因此，建议国家和省级等各级基金委员会继续资助“CT23影响HCC发生、进展的机制” 的研究，为HCC的诊疗提供新思路和新靶点。

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