α-Enolase特定位点磷酸化修饰对多柔比星诱导心肌细胞凋亡的调控作用及机制研究

Cardiomyocyte apoptosis is a common pathological alteration in heart disease which results in systolic dysfunction and eventually heart failure. Recently, the phosphorylation of specific proteins in controlling cardiomyocyte apoptosis has attracted considerable attentions. According to our previous study, α-enolase plays an important role in cardiomyocyte apoptosis, which suffers complex changes in its subcellular distribution and biological function. In the present project, we are going to study the involvement of α-enolase phosphorylation in cardiomyocyte apoptosis as well as the underlying mechanism. In doxorubicin-treated cardiomyocytes and rat hearts, the phosphorylated amino acid residues of α-enolase are going to be analyzed by affinity chromatography and LC/MS. Then the role of the phosphorylated residues in cardiomyocyte apoptosis is going to be investigated by technologies including DNA mutation, gene clone and overexpression at a cellular level and in animals. The underlying mechanism is also going to be studied. Our findings will explain the molecular basis of α-enolase’s multi-functions and its cellular compartmentalization, and raise the possibility that the protein may be utilized as a target to prevent cardiomyocyte apoptosis and heart failure.

心肌细胞凋亡是多种心脏疾病最终不可逆转归为心力衰竭的根本原因。目前，特定蛋白磷酸化修饰在心肌细胞凋亡中的作用日益引起关注。我们前期研究发现，兼职功能蛋白α-enolase是调控心肌细胞凋亡的重要因子，在凋亡过程中，α-enolase的亚细胞定位和生物功能历经复杂的动态变化，提示其在期间可能发生了翻译后修饰状态的改变。本课题将在此基础上，采用亲和层析和免疫印迹技术研究凋亡诱导因子多柔比星作用下，心肌α-enolase磷酸化水平的改变；并采用LC/MS鉴定发生磷酸化修饰变化的氨基酸残基；进一步利用DNA突变与基因过表达技术，在细胞和动物水平深入研究α-enolase特定位点磷酸化修饰对心肌细胞凋亡的调控作用，并探讨相关分子机制。本研究将发现α-enolase亚细胞定位与功能调节的结构基础，也为α-enolase作为心力衰竭治疗靶点的研究和开发提供科学依据。

α-Enolase是经典的糖酵解催化酶，也是近年来备受关注的兼职功能蛋白，有证据表明其磷酸化修饰有与兼职功能的调节存在密切关系。前期研究发现α-enolase是心肌细胞凋亡的重要调控分子，在凋亡过程中，α-enolase的表达、亚细胞定位和生理病理功能历经复杂的动态变化。本项目在此基础上，建立多柔比星（doxorubicin, Dox）诱导的体内外大鼠心肌细胞凋亡模型，分析心肌细胞凋亡过程中α-enolase蛋白磷酸化水平的动态变化，研究该蛋白特定位点磷酸化修饰对凋亡信号发生和传递的调节作用，并深入探讨其作用机制。Phos-tag western blot结果表明，在大鼠Dox心肌病模型中，α-enolase蛋白磷酸化共价修饰程度增高；在Dox诱导的H9c2心肌细胞凋亡过程中，α-enolase蛋白磷酸化水平也呈时间依赖性上调。进一步利用生物数据库预测潜在的磷酸化的氨基酸残基，根据综合分析结果构建多个磷酸化位点突变型α-enolase过表达质粒并分别转染入H9c2心肌细胞内进行检测。结果显示，与野生型α-enolase过表达质粒组相比，S268A、Y270A、T272A突变型α-enolase质粒转染的细胞凋亡程度明显减轻，各凋亡信号的激活水平也下降，提示α-enolase蛋白S268，Y270，T272位点的磷酸化促进了心肌细胞凋亡的发生发展，有待于进一步明确和深入的研究。此外，本研究还初步发现，Y270和T272位点的磷酸化参与了对α-enolase蛋白胞浆-胞核定位的调节。总之，本项目从“质变”的角度揭示了α-enolase蛋白特定位点的磷酸化修饰动态变化与心肌细胞凋亡的调控关系，有助于人们从细胞和分子水平揭示α-enolase在心脏疾病中兼职功能发挥的结构基础。本课题的研究发现将为α-enolase 作为心脏疾病诊断和治疗靶点的研究和开发提供新的依据和思路。

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