结构生物学指导的HBV治疗性抗体人源化及其关键技术研究

Hepatic disease like Hepatitis, live cirrhosis and live cancer caused by chronic Hepatitis B virus (HBV) infection is a worldwide public health problem. Currently available anti-HBV drugs appear to have very limited effects in inducing HBsAg clearance in patients with Chronic hepatitis B (CHB). Recently along with the development of antibody engineering, immunotherapy through antibody infusion is demonstrated to be a new treatment for chronic viral infection. From previous study, we identified a novel E6F6 mAb, which binds to a unique epitope on HBsAg and shows potent viral suppression effect in vitro and in vivo. The humanization of E6F6 mAb is of significance to increase its potential application and provide a new strategy for CHB treatment. In preliminary experiments, we found that the FRs (Framework regions) humanization of E6F6 will induce conformational change of antibody-antigen interaction, so result in the antibody affinity reduction. To improve the affinity of humanized E6F6, X-ray crystallography and cryo-electron microscopy will be used to investigate the antibody neutralizing mechanism and explore critical area of antibody-antigen binding. Aided with homologous modeling and docking platform, we will use these critical residues to design phage antibody library for CDRs (Complementary determining regions) affinity maturation. Humanized E6F6 with high affinity will be the superior candidate for developing therapeutic antibodies against HBV, which facilitate the E6F6-based immunotherapy to improve the clinical management of CHB. Importantly, this structure biology guided humanization will give us a new tool for better design of therapeutic antibody engineering.

慢性HBV感染引发的肝脏疾病是全世界范围的公共健康问题，当前药物难以实现完全治愈。近年来随着抗体工程技术的发展，由抗体介导的免疫治疗有望为慢乙肝感染提供新的治疗策略。在前期工作中，课题组发现一株针对乙肝病毒表面抗原上全新特定表位的鼠源单克隆抗体E6F6，能高效清除转基因小鼠体内的病毒，并有效中和体内外HBV感染。因此，对鼠源E6F6进行人源化改造，可提高其临床应用潜力，对于慢乙肝新药研发具有十分重要的意义。但通过对E6F6的前期人源化中发现，其骨架区氨基酸的改变可能引起结合构象的变化，从而导致抗体亲和力下降。本课题拟通过噬菌体展示技术，结合晶体及低温电镜结构解析，利用同源建模及分子对接，揭示抗体中和保护的分子机制，在其指导下对互补区进行亲和力成熟，获得人源化程度高、亲和力高的治疗性抗体侯选分子，推进E6F6抗体药物的研发进程，为慢乙肝的临床治疗提供新的手段，为抗体人源化改造提供新的策略。

鼠源单克隆抗体E6F6是一株针对乙肝病毒表面抗原上全新特定表位的抗体，能高效清除转基因小鼠体内的病毒，并有效中和体内外HBV感染。采用CDR移植法我们获得了E6F6人源化抗体B11，但其亲和力大大下降。为了解决这一问题，我们以结构生物学为指导进行 CDRs 亲和力成熟，以获得亲和力提高的E6F6人源化抗体，并达到抗体药物的临床标准。首先，我们在预测的B11:HBsAg免疫复合物模型基础上，利用CHARMM力场扫描诱变的In silico亲和成熟法对B11的CDR区进行突变。我们选择了相互作用力增加最多的四个变体进行考察，发现其中具有两个点突变的huE6F6-1抗体（重链:Asp65Val；His66Leu）在体内、外均能够恢复亲代抗体的高结合亲和力、中和活性及病毒抑制等有效作用。令人惊讶的是，huE6F6-1的单次给药可持续数周的显著抑制HBV转基因小鼠的HBsAg水平。基于huE6F6-1晶体结构（1.8 Å分辨率）的分子对接，我们进一步证明了huE6F6-1中更稳定、更紧密的氢键相互作用。通过电镜观察，我们发现huE6F6-1与其亲本E6F6单克隆抗体相似，均能形成小而分散的HBV免疫复合物，暗示两者将具有相同的治疗效果，由此可揭示此类抗体的中和保护机制，并确立合理准确的结构生物学指导下的抗体人源化方法。另外，huE6F6-1的临床前理化性质研究和药代动力学表明，它是改善慢性乙型肝炎的一个稳定和理想的候选药物分子。下一步我们将在慢性乙型肝炎患者的临床实验中将huE6F6-1进行单独或联合现有抗乙肝药物治疗进行治疗，为慢乙肝的临床治疗提供新的手段。我们的结构导向方法将有助于药物开发过程中其他抗体候选分子的人源化及亲和力成熟。

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