多家族离子共转运蛋白结构模型构建及分子转运机制研究

Ion cotransporters can use Na+, H+ to mediate uphill cotransport of small molecules, and thus play important physiological functions in the organisms. Being critical targets for various diseases treatment, these transporters become a research hot spot in recent years. However, due to the technical difficulties of purification and crystallization in membrane proteins, only very few transporters had been crystalized. Based on the previous studies, we found that many proteins from multiple families possess the NhaA-like folding patterns. Therefore, we will establish screening criteria based on core functional regions and substrate binding sites, by comparing available structures and evolutionary conservation analysis. Three proteins of NhaP, LctP, and ArsB, from CPA, IT and BART superfamilies, will be used for testing the screening criteria. Some mutants involving in the core region will be constructed for physiological function verification and kinetic parameter analysis. Furthermore, the predicated sites for substrate binding will be expressed and purified, and further analyzed by FRET and Cross-linking analysis for their conformational changes. Finally, an accurate screening criteria, as well as a general structural model suitable for many sequences, will be constructed. This will provide a theoretical basis for elucidating the molecular transport mechanism of relevant transporters.

离子共转运蛋白能够利用Na+、H+等实现逆浓度梯度转运小分子物质，在生物体中承担着重要的生理功能。近年来作为各种疾病治疗重要的药物靶点而成为研究热点。但由于膜蛋白表达纯化及结晶等技术困难，目前仅有少数的转运蛋白获得晶体结构。我们发现来源于多个家族的相关蛋白均具有类似NhaA的折叠方式，因此拟通过已知蛋白结构和进化保守性分析建立基于蛋白结构核心功能区域和底物结合位点的筛选标准。获得符合筛选标准的蛋白序列并选取CPA、IT和BART超家族的NhaP、LctP和ArsB蛋白进行实验验证。首先选取核心功能区域保守位点进行突变，对突变体进行生理功能验证和动力学参数变化分析；构建底物结合关键位点突变体蛋白并表达纯化，通过FRET、Cross-linking水解等技术研究突变体蛋白的构象变化。最终建立准确的筛选标准和涵盖较广的结构模型，为相关转运蛋白的分子转运机制和药物设计提供理论依据。

本项目主要围绕含有不连续螺旋的离子转运蛋白，进行生物信息学分析并预测共性保守序列及结构特征，建立了系统的转运蛋白结构预测及膜蛋白转运功能及构像研究方法，并选择代表性蛋白对不同类型不连续螺旋的离子转运蛋白进行关键结构特征及转运机制解析。.首先建立了基于序列（进化保守性分析）-结构（同源建模、构像分析）-功能（定点突变和膜活性检测）的研究方法体系。首先对课题组前期研究的IT超家族NhaD转运蛋白进行分析，预测该蛋白含有典型的发夹型不连续螺旋结构而非原有文献预测的X型不连续螺旋结构；进一步建立结构模型并对活性中心及pH sensor进行了分析预测和验证。另外选择IT家族的ArsB转运蛋白进行分析验证，同样发现ArsB具有类似的发夹结构特征并建立了结构模型，解析砷酸盐的分子外排机制。相关研究结果发表在Mol. Microbiol.（2022，118:244-257）、Biotechnol. Lett.（2021，43:825-834）上。.利用建立的研究方法，对IT家族砷酸盐转运蛋白Acr3进行关键结构特征分析和验证。基于来自枯草芽孢杆菌的Acr3Bs蛋白进行进化保守分析，结合结构模型、定点突变和构像变化研究，预测并证明了Acr3蛋白结构与NhaA折叠方式相同，为X型不连续螺旋折叠；解析了参与底物结合或转运的重要基序和关键位点。相关研究成果发表在FASEB J. 上（2022，36:e22659）。LysE蛋白为谷氨酸棒杆菌中唯一已知的L-精氨酸和L-赖氨酸外排蛋白，通过系统解析关键结构特征并筛选底物合区域位点进行点饱和突变和迭代饱和突变，获得了使LysE的精氨酸转运能力提高、氨酸外排作用降低的双突变体蛋白，使得精氨酸产量提高6.2%，研究成果已投稿Metab. Eng.。.将建立的研究方法拓展到金黄色葡萄球菌的多药外排泵NorA转运蛋白。解析了NorA II型转运蛋白强外排功能的关键结构特征，鉴定了MFS家族的典型保守基以及两个新保守基序（Motif-1和Motif-2）及关键位点；通过多点突变体及FRET实验证明两个motifs可以引起蛋白质构象变化从而影响蛋白质功能，为NorA抑制剂的研发提供了理论依据，相关研究成果发表在J. Antimicrob. Chemother.（2021, 76:1420–1427; 2022, 77: 675–681）。

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