揭示金属膜蛋白动态特性的强磁场多频电子自旋共振设备搭建和新技术

Metallo-membrane proteins are playing vital roles in cellular process, but the research methods and progress of metallo-membrane proteins are much lagged behind other membrane proteins. Electron spin resonance can effectively illustrate the metal binding coordination and dynamic properties of metallo-membrane proteins, but the commercial instruments in China are mainly in single-frequency (9.5 GHz) and single field (0.33T), which is hindered by the low sensitivity and poor resolving power during the protein dynamic studies. In this proposal, we will (1) construct the continue wave, multi-frequency (62-690 GHZ), high field (0-25 T) ESR system; (2) construct the combinational cryo- and variable-temperature system (4.2K – 300K); (3) develop the data collection and process protocols for metallo-membrane proteins using multi-frequency and high field ESR. Eventually, we can dramatically improve the ESR signal and spectrum of the metal ions and spin radical labels. This proposal will focus on the ferriportin, taking advantage of the constructed multi-frequency and high-field ESR facility and data processing, to illustrate the coordination of metal ions in the ferriportin and the dynamic structural conformations of the protein. We are aiming at providing a general ESR facility and methods for the dynamic property studies of metallo-membrane proteins.

金属膜蛋白在细胞生理过程中起着核心作用，但是其研究方法和进展远远落后于其他膜蛋白。电子自旋共振（ESR）由于能揭示金属膜蛋白中金属配位和动态特性而得到广泛关注，但是国内商业单频（9.5GHz）、低场（0.33T）ESR在研究蛋白质动态特性时面临灵敏度不高、解析能力严重不足等技术障碍。本项目将：（1）搭建连续波多频/高频（62-690GHz）高场（0-25T）ESR系统；（2）组合搭建低温变温系统（4.2K-300K）；（3）发展基于多频高场ESR的金属膜蛋白动态特性分析的数据处理和分析方法，以极大提高检测金属膜蛋白中金属离子或自由基标记信号的信噪比和谱分辨率。本项目将以与贫血症密切相关的转铁蛋白为研究对象，在多频高场ESR设施搭建及数据分析方法的基础上，开展转铁蛋白中金属离子的配位分析和跨膜转运金属离子的动态特性机制，提供针对金属膜蛋白动态特性研究的通用ESR研究平台和方法。

金属蛋白和金属酶在生命过程中起着催化生化反应、介导电子传递等核心作用，但是其研究方法和进展远远落后于其他蛋白质。电子自旋共振（ESR）是揭示金属蛋白中金属配位、价态、自旋态和金属酶催化机制等的有效手段，但是国内商业单频（9.5GHz）、低场（0.33T）ESR在研究蛋白质动态特性时面临灵敏度不高、解析能力严重不足等技术障碍。在本项目支持下，依托稳态强磁场实验装置的高场水冷磁体，成功搭建了国内首台连续波高场高频/多频ESR系统，磁场范围0-25T，频率范围50-690GHz，温度范围2-320K，灵敏度和信噪比均优于项目设定的研究目标，相对于常规X波段谱仪可以极大提高谱图分辨率及对大零场裂分体系的检测、研究能力。应用该高场高频ESR系统，在单分子磁体、磁性材料、金属氧化物等领域开展了多个研究工作，取得了较好的研究成果。另一方面，针对生物体系中多个重要的金属蛋白和金属酶体系，应用ESR方法以及荧光光谱、光谱电化学、时间分辨等多种技术开展了深入研究，揭示了其结构特征、催化机制和电子传递机制，并在基于电子传递路径基础上的金属酶设计方面取得了一定的进展，也发展起了围绕金属蛋白催化机制研究的“ESR-光谱-电化学-定点标记-时间分辨”等多种技术联用的研究平台。依托本项目，培养了高场ESR设备搭建与应用相关研究生共8名，在Nat Commun、ACS Catal、New J Phys等期刊共发表科研论文13篇，授权4项ESR设备相关的发明和实用新型专利。本项目的完成，不仅成功搭建了国内首台依托稳态高场磁体（25T）的高场高频ESR装置，将广泛应用于材料、物理、化学等多个领域的前沿研究，并发展了围绕金属蛋白催化机制研究的ESR联用方法平台，将继续应用于与生命健康相关金属蛋白的研究中。

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